Igazgatóság Prof.
A Kisállatok Orvosi Klinikájából, a müncheni Ludwig Maximilians Egyetem Állatorvosi Karának Kisállatok és Háziállatok Belgyógyászati Tanszékének elnöke. Katrin Hartmann Készült Prof. Dr. irányításával. Katrin Hartmann Genetikai és tápláló tényezők a diabetes mellitus kialakulásában kutyákon: Tanulmányok négy jelölt gén polimorfizmusáról és a D-vitamin ellátásáról Nyitó disszertáció állatorvosi doktori cím megszerzéséhez a müncheni Ludwig Maximilians Egyetem állatorvosi karán, Jannis Uhrig Karlsruhe Münchenből 2007
Nyomtatás a müncheni Ludwig Maximilians Egyetem állatorvosi karának jóváhagyásával Dékán: Előadó: Társbíró: Univ.-Prof. Dr. E. P. Märtlbauer Univ.-Prof. Dr. Hartmann Prof. Dr. Goldberg PhD-nap: 2007. július 20
Tudjuk, mitől nőnek a virágok, de nem tudjuk, miért van mindannyiunk tudása a DNS-ről, de mégis meghalunk az anyukám
4.5. 25 (OH) D-vitamin-szint mérése. 61 4.6. 1,25 (OH) 2 D-vitamin-szint mérése. 62 V. Megbeszélés. 64 1. A genotipizálási módszerek összehasonlítása. 64 2. A diabetes mellitus etiológiája emberben és kutyában. 65 2.2 Genetikai tényezők a diabetes mellitus kialakulásához. 65 2.3 A D-vitamin státusza mint tápláló tényező a cukorbetegség kialakulásában. 68 3. A tanulmány korlátai. 69 3.1. Állatszám. 70 3.2. A betegek csoportja. 70 3.3. Ellenőrző csoport. 71 3.4. Dizájnt tanulni. 72 4. Jelen tanulmány relevanciája. 72 5. Kilátás. 73 VI. Összegzés. 76 VII. VIII. Összegzés. 78 Irodalomjegyzék. 80
A rövidítések betűrendes felsorolása 7-DHC: 7-dehidrokoleszterin ADA: American Diabetes Association AGE: Advanced Glycosylated Endproduct ALP: Alanine Aminotransferase AP: Alkaline Phosphatase APC: Antigen-presenting Cell ARMS: Amplification Refractory Mutation System CTLA4-Cytocytotoxic T: Ciklusküszöb DDG: Német Diabetes Társaság DKA: Diabéteszes Ketoacidosis DLA: Kutya leukocita antigén D. m.: Diabetes mellitus EDTA: Etilén-diamin-tetraecetsav EPI: Exokrin hasnyálmirigy-elégtelenség GAD65: Glutamát humán dekarboxiláz GH: Növekedési Hormon HGVS: Leukocita antigén IA-2/ICA-512: tirozin-foszfatáz IBD: gyulladásos bélbetegség ICA: szigetsejt-antigén IDD: inzulinhiányos cukorbetegség IDDM: inzulinfüggő cukorbetegség Mellitus IFN-γ: interferon-γ IL-2: interleukin-2 IRD: Inzulinrezisztencia-cukorbetegség ISAG: Nemzetközi Állatgenetikai Társaság LADA: Látens autoimmun cukorbetegség felnőtteknél LYP: Limfoid-tirozin-foszf atase MHC: Fő hisztokompatibilitási komplex MODY: A fiatal MS érettségi kezdeti cukorbetegsége: Szklerózis multiplex
NADPH: redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid NIDDM: nem inzulinfüggő diabetes mellitus Retinoid X receptor SD: standard deviáció SNP: egy nukleotid polimorfizmus T1DM: I típusú diabetes mellitus TBE: TRIS-borát-EDTA TE: TRIS-EDTA TGF-β: transzformáló növekedési faktor β TNF-α: tumor nekrózis faktor-α VDR: D-vitamin- VDRE receptor: D-vitaminra reagáló elemek VIP: vazoaktív bélpolipeptid VUW: Bécsi Állatorvostudományi Egyetem WHO: Egészségügyi Világszervezet
II. Irodalmi áttekintés 4 Az elektronmikroszkóp homogén, átlátszatlan, apró szemcséket tárol, amelyek a szigetsejtek körülbelül 5% -át teszik ki. Az endokrin hasnyálmirigy-sejtek legkisebb és nagyon heterogén csoportja, a PP-sejtek, gasztroenteropancreatikus polipeptid hormonokat választanak ki, például a hasnyálmirigy-polipeptidet (PP) vagy a vazoaktív bélpolipeptidet (VIP). A hasnyálmirigy endokrin sejtjeit fenestrált kapillárisok sűrű hálója veszi körül, és exocitózis útján felszabadítják szekréciójukat a véráramba. A hematoxilin-eozin festéssel nem lehet őket megkülönböztetni, de az általuk termelt hormonok immunhisztokémiai festésével nagyon jól azonosíthatók (MOSIMANN & KOHLER, 1990; SINOWATZ, 2000; BÖCK & LIEBICH, 2004). 1.3. Inzulin Az inzulin egy peptid hormon, amely nagy homológiával rendelkezik a különböző emlősfajok között. A kutya inzulin szekvenciájában megegyezik a sertés inzulinnal (www.ebi.ac.uk/swissprot). Receptorain keresztül hat mind a glükóz homeosztázisában, mind a zsírok, fehérjék és ketontestek anyagcseréjében. 1.3.1. Inzulinképződés és inzulinszekréció Az inzulin pre-inzulinként képződik a hasnyálmirigy ß-sejtjeiben, és kutyákban 106 aminosavból áll, amelyek szignálszekvenciát alkotnak, valamint egy A és egy B láncot, amelyet közbenső kapcsolat, az úgynevezett C- Összekapcsolandó peptid. A 82 aminosavú proinzulin a szignálszekvencia szétválasztásával és három diszulfid-híd kialakításával jön létre. A folyamat további folyamán a C-peptidet szétválasztják, és a kapott inzulint, amely kutyákban 51 aminosavból áll (SMITH, 1966), cinkionhoz kötődve hexamerként, granulátumokban tárolják a sejt felszínén, és az emelkedő vércukorszintre reagálva a C- A véráramba ekvimoláris mennyiségben szekretált peptid. Mivel prekurzoraiból az úgynevezett prohormon konvertázok révén az inzulin képződése csak a tároló granulátumokban megy végbe, ha az inzulin szekréciója gyors, a proinsulin is felszabadul a véráramba; biológiai aktivitása azonban kevés. Továbbá a szemcsékből származó különféle fehérjék a keringésbe kerülnek. A legtöbbnek szerepet tulajdonítanak az inzulin optimális tárolási és feldolgozási körülményeinek kialakításában. Nem zárható ki azonban, hogy némelyikük biológiai aktivitást is mutathat. Egy
II. Irodalmi áttekintés 8, valamint a kapillárisok szűkülete a glomerulusban és a retinában. Ez a biokémiai reakció valószínűleg hozzájárul az emberben ismert és féltett D. m. Hosszú távú károsodásának nagy részéhez, mint például az arteriosclerosis, a diabéteszes nephropathia és a diabéteszes retinopathia (VLASSARA et al., 1986). Mivel ezek a szövődmények csak több évtized alatt alakulnak ki, klinikailag kevésbé fontosak a kutyák számára (FELDMAN & NELSON, 2004). A kutya szempontjából releváns D. m. Hosszú távú következményeit az 1.6.3. Szakasz ismerteti. foglalkozott. Normális vércukorszint mellett a glükóznak csak mintegy 3% -a bomlik le az úgynevezett szorbit útvonalon az aldózreduktáz enzim által szorbittá és végül fruktózzá. Hiperglikémiás állapotban ez az érték akár 30% -ra is nő. Mivel a NADPH-t (redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid) fogyasztják, amikor a glükózt a poli-inozitol útvonalon lebontják, NADPH-hiány lép fel a sejtben. A NADPH a glutation-peroxidáz szubsztrátja, amely megvédi a sejtet a szabad gyököktől és ezáltal az oxidatív stressz okozta károsodásoktól. Ily módon az aldóz-reduktáz fokozott aktivitása, amely feltételezhetően szerepet játszik az AGE-k kialakulásában is, hozzájárulhat a vaszkuláris endotheliák károsodásához és ezáltal a D. m. Fent említett szövődményeihez emberben (SRIVASTAVA et al., 2005). Úgy tűnik, hogy ezek a mechanizmusok a kutya D. m-ben is kisebb jelentőségűek. A kutya rövid élettartama miatt, de úgy tűnik, hogy a szorbit út fontos szerepet játszik a diabéteszes szürkehályog kialakulásában mind kutyákban, mind emberekben (LIGHTMAN, 1993; WILKIE és mtsai., 2006). 1.5. A kutyák cukorbetegségének epidemiológiája Egy amerikai kutatás szerint, amely retrospektíven hasonlította össze a kutyák fajtaeloszlását D. m-vel. Az 1970–1999-es években más okok miatt ugyanarra a klinikára bemutatott kutyák fajtaeloszlásával tizenkét fajta különösen nagy a D. m. kialakulásának kockázata (ausztrál terrier, közepes schnauzer, szamojéd, miniatűr schnauzer, Fox terrier, Keeshond, Bichon Frise, Finnenspitz, Cairn Terrier, miniatűr uszkár, szibériai husky, játék uszkár). A kutyák többsége öt és tíz év közötti volt a diagnózis felállításakor, a D. m. Legnagyobb előfordulása a tizenegy és a 15 év közötti korcsoportban (GUPTILL et al., 2003).
II. Irodalmi áttekintés 10 1993). A hiperlipidémia laboratóriumi megállapítás, amely gyakran megfigyelhető, mivel a vérben fokozott lipolízis inzulinhiány esetén a szabad zsírsavak szintjének növekedéséhez vezet. A hiperlipidémia fokozott zsírraktározást eredményez a májban, és ezáltal máj lipidózishoz vezet (JAMES & DAY, 1999). Ez az alkalikus foszfatáz (AP) és az alanin-aminotranszferáz (ALT) májenzimek aktivitásának növekedéséhez vezet. Egy 208 D. m. Kutyával végzett vizsgálatban az összes kutya 90% -a növekedett az AP aktivitásában és 78% -kal az ALT aktivitásában, a kutyák 42% -ában lipémiás volt a szérum (HESS et al., 2000) . 1.6.2. Alapvető betegségek A hormonális hatások, a gyógyszeres kezelés és a hasnyálmirigy és más szervek betegségei a D. m. Elvileg az inzulinrezisztencia alapján történő D. m. Reverzibilis, és olyan esetekben, amikor hiperadrenokortikizmus vagy fokozott inzulinigény van a diestrusban, az alapbetegség korai kezelése vagy azonnali kasztrálás néha átmenethez vezethet egy átmeneti állapotból egy állandóan megnyilvánuló D. .m kerülendő. A legtöbb esetben azonban már túl sok β-sejt pusztult el glükóz-toxicitás vagy szekréciós kapacitásuk kimerülése miatt az elegendő inzulinszekréció fenntartása érdekében, így a reverzibilis, inzulinrezisztens D. m. Irreverzibilis inzulinhiányos cukorbetegséggé válik (FELDMAN & NELSON, 2004; NORMAN et al., 2006). Akut és krónikus hasnyálmirigy-gyulladás Az akut vagy krónikus hasnyálmirigy-gyulladás olyan gyakori betegségek, amelyek a hasnyálmirigy endokrin sejtjeinek pusztulásához és ezáltal az inzulinszekréció hiányához vezetnek; az exokrin hasnyálmirigy daganatai ritkán fordulnak elő (ALEJANDRO et al., 1988). Az akut hasnyálmirigy-gyulladás a β-sejtek gyors pusztulásához és ezáltal az inzulinszekréció hiányához vezet, míg a krónikus hasnyálmirigy-gyulladás a gyulladással összefüggő inzulinrezisztencia legfontosabb oka (FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.2.2. Hyperadrenocorticismus A glükokortikoidok, akár a szervezet által termeltek, akár iatrogén módon szállítva, fokozott glikogenolízissel és glükoneogenezissel vezetnek a vércukorszint emelkedéséhez. Inzulin antagonistaként hatnak, és a D. m. Továbbá a glükokortikoidok a
II. Irodalmi áttekintés 14 mikroalbuminuria, megnövekedett a transzformáló növekedési faktor β (TGF-β) termelése. Ez a növekedési faktor felelős a mátrixfehérjék fokozott extracelluláris lerakódásáért a glomerulusban; ez az alapmembrán megvastagodásához és a mesangium tágulásához vezet (SCHENA & GESUALDO, 2005). Mivel a kezdeti szakasz időtartama körülbelül öt év, és a diabéteszes nephropathia csak körülbelül 20 év után alakul ki teljesen, a házi kutyák rövidebb élettartama miatt csak nagyon ritkán fordul elő (STRIPPOLI et al., 2003; FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.3.6. Diabéteszes ketoacidózis A DKA a szervezet anyagcseréjének életveszélyes kisiklása egy kezeletlen vagy rosszul beállított D. m. Miatt. A hiperglikémia, az acidózis és a ketózis biokémiai triádja jellemzi. Amint már leírtuk, az inzulin és a glükóz hiánya a test perifériás sejtjeiben fokozott lipolízishez és keton testek képződéséhez vezet a májban, mivel a szabad zsírsavak acetil-CoA-vá oxidálódnak, amelyet a sejt glükózhiánya miatt nem adnak a citromsav-ciklushoz. gyengé savakká, acetonná, acetoacetáttá és β-hidroxi-butiráttá alakulhat. Ezt a hatást fokozza az inzulinantagonista hormonok (különösen a glukagon és a glükokortikoidok) megnövekedett koncentrációja, a fokozott glükoneogenezis és a glikogenolízis a vércukorszint további emelkedéséhez vezet. Ez ozmotikus diurézishez, elektrolitvesztéshez és dehidrációhoz vezet (SONKSEN & SONKSEN, 2000; GOODMAN, 2003). A keton testeket számos testsejt felhasználhatja, beleértve az agyat is, energiatermelésre, de ha feleslegesen képződnek, hozzájárulnak a szervezet anyagcseréjének súlyos kisiklásához. Gyenge savakként működnek, ezért a pufferrendszerek kimerüléséhez és a metabolikus acidózishoz vezetnek. Szabadon szűrődnek a glomeruluson, és hidrofilitásuk miatt fokozzák az ozmotikus diurezist. A ketontestek negatív töltése miatt kationok, például nátrium és kálium, de kalcium és magnézium is kiválasztódik a vérből a vizeletbe a vér elektroneutralitásának fenntartása érdekében. Ez a nátrium és a kálium kimerüléséhez és további, súlyos kiszáradáshoz vezet. Ha nincs glükóz beáramlás a test sejtjeibe, kálium nem juthat be a sejtbe, mivel ez egy
III. Anyagok és módszerek 40 vagy a háziorvosok csak komplikációk jelentkezésekor utalták őket a klinikára. 1.1.3. Faj és nemi megoszlás 13 kutya volt vegyes fajta; leggyakrabban a törzskönyvezett kutyák voltak a tacskók, a nyugat-felföldi fehér terrier és uszkár (egyenként négy beteg) és a német juhászok (három beteg, lásd a 2. táblázatot). Leggyakrabban kis terrier fajták (nyugat-felföldi fehér terrier, yorkshire terrier, Jack Russel terrier, valamint walesi és skót terrierek voltak jelen összesen tíz betegnél) képviseltették magukat. A müncheni orvosi kisállat-klinika kutyafajtáit külön felsoroljuk a 3. táblázatban, hogy összehasonlíthassuk őket az orvosi kisállat-klinika teljes betegpopulációjának leggyakoribb fajtáival a vizsgálati időszak alatt. 28 kutya volt D. m. Nőstény volt, ebből 15 ivartalanított és 13 nem kasztrált, 23 kutya D. m. Hím volt, közülük tizenegy ivartalanított és tizenkét nem kasztrált. 2. táblázat: A cukorbetegségben szenvedő kutyák leggyakoribb fajtái (teljes vizsgálati populáció) Fajta Vegyes fajta 13 tacskó 4 uszkár 4 nyugat-felvidéki fehér terrier 4 rottweiler 3 német juhász 3 yorkshire terrier 2 Jack Russel terrier 2 egyéb 16
III. Anyagok és módszerek 50 amplifikálják. Mivel a primerek kötési hatékonysága eltérő volt, a Ct értékek a különböző allélokban azonos mennyiségű DNS ellenére különböztek, ezért egy Ct 1 C) olvadási hőmérsékletükben különböznie kell. Számos előzetes teszt során optimalizálni kell az optimális hőkezelési hőmérsékletet és az allél-specifikus primer koncentrációját (LINDBLAD-TOH et al., 2005). Működő megközelítést csak az SNP-k egyikére lehetett kialakítani; a primereket és a reakció körülményeit a 3. táblázatban adjuk meg. A PCR-t 96 lyukú lemezeken (Thermowell Gold PCR Plates, Corning Inc., Corning, USA) hajtottuk végre, egy AB 7300 hőciklerrel (Applied Biosystems, Foster City, USA). A PCR-t disszociációs lépés követte, amelyben a PCR-termékek olvadáspontját hőmérsékleti gradiens (60-95 C) segítségével határoztuk meg. Vagy a fluoreszcencia görbe negatív első származéka mutatott csúcsot alacsonyabb olvadási hőmérsékleten, majd a rövidebb amplikon felerősödött, és a minta adenint vagy timint tartalmazott az SNP helyén, vagy volt olyan csúcs, amelynek magasabb a hőmérséklete, akkor a minta homozigóta volt guanin vagy citozin esetében. A heterozigóta állatok két csúcsot mutattak, egy-egy csúcsot a megfelelő hőmérsékleten. Az alapozókat az Operon Biotechnologies GmbH-tól kaptuk, Köln, Németország. A Power SYBR Green PCR Master Mix-et (Applied Biosystems, Foster City, USA) használtuk. Annak érdekében, hogy ezt az új genotipizálási módszert össze lehessen hasonlítani az ARMS-PCR-rel, az SNP V7-et mindkét módszerrel genotipizáltuk.
III. Anyagok és módszerek 55 9. táblázat: SNP V7 Meltingcurve-PCR; Alapozó, PCR-program, reakcióelegy, félkövérrel nyomtatva: Alapcsere-alapozó 1 (allélspecifikus) GCGGGCAGGGCGGCCCTGGCTAGCCCTGAC Primer 2 (allélspecifikus) GCGGGCCCTGGCTAGCCCTGAT közönséges alapozó AGTCAGGTGCCGTCCCTC 60 mp szintézis 72 C 30 mp kötegelt H 2 O 7,8 µl (20 µl) 1. primer (10 µm) 0,4 µl 2. primer (5 µm) 0,4 µl közös primer (10 µm) 0,4 µl 2x SYBR-Green Mastermix 10 µl DNS-sablon 1 µl 2.8. Statisztikák A statisztikai értékelést az SPSS for Windows 13.01 verzióval (SPSS Inc., Chicago, USA) végeztük. A párosítatlan Student t-tesztet használtuk a D-vitamin átlagértékeinek összehasonlítására, és a χ 2 tesztet az allél frekvenciák összehasonlítására. 0,05 p-t tekintettünk szignifikánsnak. A teszt szilárdságának és a szükséges állatok számának elemzését a Power And Precision készülékkel (Biostat Inc., Englewood, USA) végeztük.
IV. Eredmények 56 IV. Eredmények 1. Szekvenálás Primer párokat hoztunk létre a VDR, CTLA4, LYP-PNP és DLA gének összesen 18 szakaszához, a metszeteket PCR-rel amplifikáltuk, és a tisztított, replikált DNS-t szekvenáltuk. A primerpárokat úgy választottuk meg, hogy az összes exonból a lehető legtöbb részt és az exon-intron határokat felerősítsük. 1.1. A D-vitamin-gén szekvenálása A szekvenált génszegmensek összehasonlításakor hét SNP-t találtak a VDR-génben, közülük hármat intronokban, hármat exonokban és egyet a nem lefordított 5 régióban (1. ábra). 1. ábra: Egyetlen nukleotid polimorfizmusok (nyilak) a D-vitamin receptor génben (kódoló régiók (exonok, szürke négyzetekkel ábrázolva)) 1.2. A citotoxikus T limfocita antigén 4 gén szekvenálása Két SNP-t találtak a CTLA4 génben, egyet a 2. exonban és egyet a 4. exonban (2. ábra). 2. ábra: Egyetlen nukleotid polimorfizmusok (nyilak) a citotoxikus T limfocita antigén 4 génben (kódoló területek (exonok, szürke dobozok)
IV. Eredmények 57 1.3. A limfoid tirozin-foszfatáz gén szekvenálása Egy SNP-t találtak a LYP génben, amely a 13. exonban található, és aminosavcserét eredményezett (fenilalanin> leucin). 3. ábra: Egyetlen nukleotid polimorfizmusok (nyilak) a limfoid tirozin-foszfatáz génben (kódoló területek (exonok, szürke négyzetekkel ábrázolva). Az összes SNP, amelynek pontos elhelyezkedése és elnevezése a Human Genome Variation Society (HGVS) nomenklatúrája szerint történik, a 10. táblázat. 10. táblázat: Az egyetlen nukleotid polimorfizmus (SNP) lokalizációja (UTR = nem lefordított régió, AS-Aust. = Aminosavcsere, PPA = alapozó-próba-vizsgálat, ARMS = Amplicon Mutation Refractory System-PCR, TM = Meltingcurve-PCR, Phe = Phenylalanine, Leu = leucin) SNP régió gén AS-Aust. PCR V1 c.-21t> c 5 'UTR VDR - PPA V7 c.501 + 3310A> G Intron 3 VDR - ARMS/TM V8 c.501 + 3434c> t Intron 3 VDR - ARMS V9 c.533c> t Exon 4 VDR - szekvenált V10 c.677t> c exon 5 VDR - ARMS V11 c.761t> c exon 5 VDR - ARMS V13 c.1150 + 1580a> g intron 7 VDR - ARMS C1 c.372c> t exon 2 CTLA4 - PPA C2 c.958a> g exon 4 CTLA4 - Fegyverek LYP c.2344a> t exon 13 LYP-PNP Phe> Leu PPA