In vitro modell a malária immunválaszainak mérésére a HIV együttfertőzés összefüggésében

Bevezetés

Az együttfertőzés, többszörös egyidejű fertőzéssel járó fertőzés a szokásos a természetes körülmények között. Az együttfertőzés nagy hatással lehet a betegség patológiájára és bármely fertőzés klinikai kezelésére. Az együttfertőzés kapcsán a vakcina és a gyógyszerek hatékonysága, valamint a diagnosztikai tesztek negatívan befolyásolhatók (áttekintés az 1. részben). Fontosságuk ellenére a kórokozók kutatásának többsége csak az egyedi fertőzéseket veszi figyelembe.

A malária és a HIV-1 (HIV) világszerte a morbiditás és a halálozás legfőbb oka. A malária és a HIV endemicitás területei széles földrajzi átfedésben vannak, így emberek millióit fenyegeti a súlyosabb klinikai betegség 2-10. A két betegség negatívan hat egymásra. HIV-fertőzött egyéneknél magasabb a HIV vírusterhelés és a CD4 + T-sejtek számának átmeneti csökkenése figyelhető meg maláriafertőzés során, míg a malária parazita terhelések, valamint a klinikai és súlyos malária kockázata társfertőzött egyéneknél 2,3,5,7, 8,10 magasabb. Azokat a mechanizmusokat, amelyek révén a HIV növeli a malária súlyosságát, nem teljesen értik, és további vizsgálatokra van szükség.

Itt leírunk egy módszert, amellyel a malária és a HIV együttfertőzés in vitro tanulmányozható. Ez a módszer különösen lehetővé teszi a malária-specifikus immunválaszok tanulmányozását a HIV-fertőzés kapcsán. Protokollunk sokoldalú kooperációs rendszert ír le frissen izolált perifériás vér mononukleáris sejtekből (PBMC) krónikusan HIV-fertőzött donorokból és az in vitro tenyésztett P. falciparum parazitizált eritrocitákból (PfRBC). A HIV antiretrovirális kezelésnek ezekre a válaszokra gyakorolt hatása tanulmányozható a HIV (+) donorok prospektív módon rögzített PBMC-jének felhasználásával is a kezelés előtt és után.

Ezt a rendszert a HIV-fertőzés malária-specifikus veleszületett immunválaszokra gyakorolt hatásának tanulmányozására használta 11,12, és meg tudta állapítani, hogy a malária-specifikus IFNy és TNF válaszok károsodtak-e NK-sejtekben, NKT-sejtekben, HIV (+) donorokból származó γδ T-sejtek a HIV antiretrovirális terápia előtt és után. Ezenkívül ezt a rendszert alkalmaztuk annak megállapítására, hogy a monocita funkciók a HIV (+) donorokban is károsodnak, de a HIV antiretrovirális terápia után helyreállnak.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Ez a protokoll megköveteli donorok toborzását a parazita tenyésztéshez szérumra és vörösvértestre, valamint HIV (+) és nem fertőzött donorokat PBMC izolálásra. Az intézményi felülvizsgálati testületeknek jóvá kell hagyniuk az összes vizsgálatot, és minden véradónak megalapozott beleegyezést kell adnia a vérvétel előtt.

FIGYELEM: Az emberi vérmintákkal és az emberi malária parazitákkal való munkavégzés elővigyázatosságot igényel. Mindig viseljen laborköpenyt, kesztyűt, és dolgozzon a 2. szintű biológiai biztonsági szekrényben. Az emberi malária véletlen perkután expozíciója esetén jelentse az egészséget és a biztonságot a profilaktikus kezelés érdekében. További biztonsági ellenőrzéseket is el kell végezni a helyszínen a HIV (+) vérrel történő munkavégzéshez. Viseljen következtetési laboratóriumi kabátot. Dupla kesztyű (a felső kesztyű latex legyen). Minden kezelést végezzen egy 2. szintű biológiai biztonsági szekrényben. Ne használjon üveget vagy éles tárgyakat. Ne használjon vízsugaras szivattyút. A virox oldat vagy a fehérítő összes szennyezett részét tegye legalább 1 órára az ártalmatlanítás előtt, 1 órával az alkalmazás után mossa meg az összes felületet viroxival és UV-vel. Ne feledje, hogy minden intézménynek meg lesz a saját saját biológiai biztonsági előírása, amelyet be kell tartani. Jelentse a HIV-fertőzött vér véletlenszerű egészségügyi és biztonsági expozícióját az esetleges expozíció utáni profilaxis értékelése és figyelembe vétele érdekében.

MEGJEGYZÉS: Különböző törzsek vannak jelen a P. falciparum malária parazitákban. ITG-t használtak ezekhez a kísérletekhez, de különböző törzseket használnak. Kiváló utasítások a Plasmodium falciparum paraziták fagyasztására és felolvasztására az MR4 13 weboldalon találhatók.

1. Hozzon létre RPMI-A-t a maláriakultúrához

Az RPMI-0 elkészítéséhez 950 ml ddH 2 O-t, 1 csomag RPMI-1640 port, 6 g HEPES-t, 2 g nátrium-hidrogén-karbonátot és 1,35 mg hipoxantint keverünk össze.
Hő-inaktivált emberi szérumot olvasztunk fel két különböző donortól. Az AB donorok a legjobbak, de bármelyik felhasználható, ha parazitákat O-típusú vörösvérsejtekben (RBC) növesztenek. Seprőcsövek keveréshez. Ha a szérum részecskéket tartalmaz, vagy vastag centrifugálás 2000 fordulat/perc sebességgel, majd 0,45 µm-es szűrőegységgel válassza ki a folyékony részt.
0,2 µl felhasználásával m szűrőegység szűrő 180 ml RPMI-0, 20 ml humán szérum (10 ml minden donortól) és 0,5 ml 10 mg/ml gentamicin.
Megjegyzés: Az emberi szérum eltömítheti a szűrőket, így egynél több szűrőegységre van szükség.
Címkézze fel a közepes palackot RPMI-A-val, a dátummal és a szérum forrásával. Hűtsük addig, amíg szükség van rá. Az RPMI-A lehűlve felhőssé válhat. Ez normális, de a növekvő felhőzet a szennyeződés jele.
Megjegyzés: a különböző donorszérumokban a parazita növekedése változó lesz. Használat előtt célszerű minden emberi szérumot tesztelni a jó parazita növekedés szempontjából.

2. Az emberi vörösvérsejtek előkészítése a parazita tenyésztéshez

Megjegyzés: A véradóknak O típusúnak kell lenniük.

Gyűjtsön össze 7-10 ml vért savas citRate-Dextrose (ACD) csövekben. Írja fel az adományozó azonosítóját és a begyűjtés dátumát a címkére.
Tárolja a vért 4 ° C-on, amíg szükséges. A vérparazita esetében használja a tenyészetet 1 hónapon belül.
Törölje le a cső tetejét 70% -os etanollal. Óvatosan távolítsa el a dugót és dobja el. Vigye át a vért egy 15 ml-es csőbe. Forgasson 3 percig 1000 x g sebességgel. Távolítsa el a plazmát aspirációval.
Az RBC azonos mennyiségű meleg RPMI-0-val való kitétele. Forgassuk 5 percig 1000 x g sebességgel. Szívással távolítsa el a zsírbőrt, szuszpendálja újra 5 ml RPMI-0-ban, és ismételje meg a mosást még kétszer.
Távolítsa el a felülúszót, és adjon hozzá annyi RPMI-A-t, hogy 50 térfogat% vörösvértestű keveréket kapjon.
Tárolja 4 ° C-on, amíg szükséges.

3. Parazita kultúrák fenntartása

4. Parazita szinkronizálás

MEGJEGYZÉS: A kísérlet előtti napon szinkronizálja a parazita tenyésztést alaninnal történő kezeléssel. Csak a gyűrűs stádiumú paraziták és a nem fertőzött vörösvértestek élik túl ezt a kezelést. Az alanin-szinkronizálás másnap tiszta trofozoitkultúrát eredményez, amelyet fel lehet használni az együtt-tenyésztési kísérletekben. Feltétlenül kezdjen egy parazita tenyésztéssel, amely a gyűrűs szakaszban élő paraziták többségét tartalmazza.

Az alanint úgy készítjük el, hogy 8,01 g alanint (300 mM) és 0,365 g Tris-t (10 mM) keverünk 300 ml ddH20-ban. Állítsuk a pH-t 7,4-re. A szűrőt 0,2 µl-rel sterilizáltuk m szűrőegység.
Az alaninoldatot 37 ° C-ra melegítsük elő.
Forgassuk le a parazitakultúrát (5 perc x 1000 x g), és távolítsuk el a táptalajt.
Pellet 19 térfogat alanin-oldattal (1 ml csomagolt vörösvértest-19 ml alanin-oldat). 15 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten.
Centrifugálás 5 perc x 1000 x g. A felülúszót elszívják. Mossa le egyszer az RPMI-0-ban. A felülúszót leszívjuk és újraszuszpendáljuk az RPMI-A-ban, és felállítjuk a hematokritot

3%. Ugyanaz, mint a lombikban, és állítsuk vissza 37 ° C-ra
Megjegyzés: Az együtt-tenyésztési kísérletekhez legalább 5% trophozoite parazitémia szükséges, 10% parasitaemia optimálisnak tekinthető.

5. Parazita és vörösvértest előkészítése együtt-tenyésztési kísérletekhez

Használjon 3 PfRBC/PBMC arányt ko-tenyésztési kísérletekben a gyulladásos válasz kiváltására. A teljes PfRBC kiszámításához számszerűsítsük a parazitémiát egy vékony vérkenet alkalmazásával, a 3.5. Pontban leírtak szerint, és a hematokritot azáltal, hogy számlálókamrával megszámoljuk az RBC/parazitakultúra milliliter számát.
A PfRBC száma = parazitémia% x összes vörösvértest/ml x ml tenyészet. Például: 10 ml tenyészet 10x106 vörösvértest/ml és 10% -os parazitémia esetén egyenlő 0,1x106/mlx10 ml = 10x106 PfRBC.
Centrifugáljuk a parazita tenyésztést 5 percig 1000 xg (RT) értéken. Szívja be a tápközeget és reszuszpendálja 6 x 106 PfRBC/ml koncentrációban RPMI-S + -ban (500 ml RPMI-1640, kiegészítve L-glutaminnal és HEPES-sel, 10% hővel kiegészítve inaktivált FBS-t, 1,5 ml gentamicint, 5 ml 100 mM nátrium-piruvátot). 5 ml 10 mM MEM nem esszenciális aminosav, 5 ml 5 mM β-merkaptoetanol).
A kontroll vért (a parazitatenyészet megtartásához használt donortól származó nem fertőzött vörösvérsejtek), kiszámítottuk a hematokrit értéket, és az RPMI-S + -ban reszuszpendáltuk ugyanannyi vörösvérsejt/ml-ben a parazita tenyészeten.

6. Humán perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC) izolálása

7. Malária/HIV együttfertőzés kultúra

8. A malária immunválaszainak kimutatása

MEGJEGYZÉS: Végezzen 4 napig kísérleti kísérleteket. A tápközeg cseréje ez idő alatt nem szükséges. Az optimális időzítés az érdeklődő cellatípustól és a feltett kérdéstől függ. A PfRBC-re adott monocita-válaszok szempontjából optimális a 12–48 órás inkubáció, míg a limfocita-válaszokat a legjobban 72–96 óra alatt figyelték meg. Az időket a kísérleti kérdés alapján optimalizálni kell. Rövidebb periódusok (2-4 óra) használhatók, ha az ép PfRBC és a PBMC kölcsönhatása érdekes.

Forgassuk a lemezt 300 × g sebességgel 3 percig pelletsejteken. Gyűjtsön 700 μl tenyészet felülúszót minden üregből.
Az idegen testek elkerülése érdekében centrifugáljuk a felülúszót 1000 xg sebességgel 5 percig.
Szükség szerint alikvotával tisztítsuk meg a felülúszót, jelöljük meg, helyezzük át és -20 ° C-on tartjuk a szekretált tényezők elemzéséig LeistRMED.
Elemezze a citokin/kemokin reakciókat ELISA-val vagy gyöngyszereléssel (kövesse a gyártó által javasolt protokollokat).
Gyűjtsük össze a lemezen maradt sejteket RNS stabilizáló oldatban, és használjuk őket mRNS expressziós elemzéshez kvantitatív valós idejű PCR 14-16 alkalmazásával.

9. Sejtspecifikus citokinválaszok intracelluláris áramlási citometriája P. PBMC-vel együtt tenyésztett falciparum-fertőzött vörösvértesten

Megjegyzés: Amint azt a fentiekben említettük, az együtt tenyésztés hossza az érdekelt sejttípustól függ. Ha a monocita válaszok érdeklik, rövidebb PfRBC inkubációs periódusra van szükség. Idővel hosszabb a veleszületett limfocita válaszok (yô T-sejtek, NK-sejtek, NKT-sejtek) esetében, és még inkább a CD4 és CD8 T-sejtek esetében. Optimalizálás szükséges.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A grafikonok az IFN szintjét mutatják & ggr; NKT sejtek termelése (Ábra 2), CD56 + CD3 + γδ-kapukkal az NKT sejtpopuláció megőrzése érdekében (az adatokat nem mutatjuk be). A sejteket festés előtt 72 órán át tenyésztettük. Miután festettük, 100 000 CD3 + sejtet rögzítettünk az áramlási citométeren, hogy elegendően nagy NK, NKT és γδ sejtek (érdekes sejtek) populációkat kapjunk. Legalább 5600 NKT sejt látható minden grafikonon. A TNF-termelést ugyanúgy kapjuk meg (az adatokat nem mutatjuk be). A grafikonok egyértelműen mutatják, hogy az IFN & ggr; A termelés alacsonyabb a HIV (+) egyedek sejtjeiben, szemben a PfRBC-nek kitett HIV (-) egyedekkel.

Az áramlási citometriás elemzés nagyon szubjektív. Ezért fontos, hogy minden kísérlethez meg legyen az összes megfelelő kontroll (lásd 2. ábra). A háttérértékeket az FMO minták felhasználásával számítottuk ki, amely lehetővé teszi a citokin festés valódi ábrázolását, pozitív kontrollként PMA/ionomicinnel stimulált sejteket használtunk (az adatokat nem mutatjuk be). A PMA és az ionomicin a T-sejtek citokintermelésének erőteljes stimulátorai. Az IFN-termelés hiánya ezekben a mintákban valószínűleg problémát jelentene a festési protokollban. Ugyanakkor más változók, például a sejtek életképessége vagy az inaktív reagensek is hibásak lehetnek.

1. ábra: A Ficoll Gradient Post Spin bizonyítéka a PBMC-k helyzetéről.

2. ábra: IFN γ termelés természetes gyilkos T-sejtek által. A folyamatábrákat CD56 + CD3 + γδ sejteken történő kapuzással állítottuk elő (minimum 5600 esemény). Stimulált P-vel kimutatható az IFNy-termelés a HIV (-) mintában. a falciparum megfertőzte a vörösvérsejteket. Ez a citokin-válasz már nem nyilvánvaló a krónikus HIV-fertőzés összefüggésében. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Protokollunkat úgy optimalizáltuk, hogy in vitro a legreálisabban tanulmányozzuk a HIV-malária együttfertőzést. Először friss emberi vörösvértestekre és szérumra van szükség a malária parazita tenyésztéshez. Ez kritikus fontosságú a malária paraziták egészséges populációjának fenntartásához. A parazita lizátumok nem helyettesíthetik az élő parazitákat, mivel a citokin termelés sokkal gyorsabb és intenzívebb az élő P alkalmazásakor. falciparum fertőzött vörösvértest (PfRBC) 17.18. Ezenkívül a sejttípusok, például az NK-sejtek aktiválásához teljes PfRBC-ra van szükség, és nem hatékonyan kezeli a parazita-lizátumokat. Ennek oka lehet a PfRBC és a leukociták közötti közvetlen kapcsolat szükségessége, vagy a parazita eredetű ligandum instabil jellege, amely kölcsönhatásba lép a sejtfelszíni receptorokkal 18. A malária PfRBC kultúrákat szintén jól szinkronizálni kell (4. protokoll) a kísérlet előtt. Szinkronizált PfRBC-k a kísérleti adatok reprodukálhatóságának javítása érdekében. Bár ez a deSchreiber protokoll a trophozoite PfRBC stádiumot használja az együtt-tenyésztéshez, könnyen módosítható a PfRBC gyűrűs stádium tanulmányozásához.

Az emberi leukociták mesterségesen HIV-fertőzöttek, és a módszert a Malaria-HIV Co-Infection Research 20 tanulmányaiban használták. Ez azonban nem modellezi az immunrendszer diszregulációját, amely krónikus HIV-fertőzéshez vezet. Ebben a közös kultúrarendszerben olyan humán résztvevőktől izolált PBMC-ket használunk, akik krónikusan HIV-1 fertőzöttek. Ha tanulmányra van szükség a résztvevők számára, fontos, hogy gondosan kiválasszuk ezt a populációt. A befogadási és a kizárási kritériumok elengedhetetlenek a minimális változatosság és a maximális reprodukálhatóság biztosításához. Kritériumaink a krónikus HIV-fertőzés (> 1 év HIV-fertőzött, a CD4 + T-sejtek száma> 50 sejt/mm 3/év csökkenéssel) egyértelmű meghatározása és az egyidejű fertőzésben szenvedők kizárása volt. Ez biztosítja, hogy az elért eredmények a krónikus HIV-fertőzés hatásainak tulajdoníthatók, és ne valamilyen más fertőzésnek. Ezenkívül, mivel a malária kizárására irányuló veleszületett immunválasz érdekelt, donorok voltunk, akiknek korábban maláriafertőzésük volt.

HIV-fertőzött kontrollokat használunk minden HIV (+) donorhoz, minden mintavételi időpontban, amelyek lehetővé teszik az adatok normalizálását. Meg kell próbálni összehangolni a HIV (+) donorjuk kontrollját legalább életkor, de lehetőleg nem szerint is (bár korábbi tanulmányunkban 12 nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a sejtrészekben vagy a citokin válaszokban a női és a férfi között. HIV-fertőzött résztvevők). Ha a jövőbeni mintavételt ütemezik, előnyös ugyanaz a HIV-fertőzött kontroll fenntartása minden mintavételi időpontban. A kísérleti válaszok számos tényezőtől függően változnak, ideértve a PfRBC-k egészségét, a szinkronizáció mértékét, a PfRBC-k parazitémiás szintjét és érettségét, valamint a hematokrit szinteket. Ügyelni kell arra, hogy ezek közül minél több legyen összhangban a kísérletek között. A HIV-fertőzött kontrollra történő normalizálás lehetővé teszi bizonyos változók számbavételét.

A mesterséges eredmények elkerülése érdekében rendkívül fontos a friss sejtek beszerzése. A minták fagyasztása és felolvasztása jelentős hatással lehet a sejtek életképességére 21,22, a citokintermelésre 23-26 és a sejtfelszíni fenotípus markerekre 27.

Ha a monociták különösen érdekesek, fontos, hogy az üveget ne használják a protokollban. Meg kell figyelni az üveg monocitáit és sok más műanyagot 28. Polipropilén műanyag pipettákat, pipettákat és csöveket használunk mindenhol, hogy minimalizáljuk a monocita tapadást és a végső eltávolítást a vizsgálati sejtpopulációinkból.

A leírt protokoll sokoldalú, amely felhasználható a reakciók tanulmányozására órákon vagy napokon belül, az érdeklődő sejtektől függően. Az optimális PfRBC által indukált citokintermelés a veleszületett limfocitákból 2 vagy 3 nap múlva mértük a kiindulási áramlási citometriát. A monociták vizsgálatakor korábbi (1 vagy 2 napos) időpontok ajánlottak. Ez a rendszer lehetővé teszi több sejttípus és sejtválasz megkülönböztetését áramlási citometriával, a szekréciós válaszok mérését a sejt felülúszóiban és az expressziós profilok értékelését a kivont RNS-ben. Ezenkívül antitestek alkalmazása specifikus receptorok blokkolására vagy semlegesítésére; ebben a rendszerben citokinek alkalmazhatók a mechanizmusok további boncolására. Sikeresen alkalmaztuk az IL-18 receptor blokádot az IL-18 receptor implikációjára a PfRBC által kiváltott IFN válaszokban 12. Ez a rendszer reális módszert biztosít a malária HIV-fertőzéssel kapcsolatos veleszületett immunválaszainak felmérésére.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.