In-Vitro elemzés

Sok olyan vizsgálat esetében, amely tesztalanyokon nem lehetséges, az in vitro vizsgálati eljárások egyre fontosabbá válnak.

Azoknál a kozmetikai termékeknél, amelyeket gyakran hosszú ideig használnak, a bőr dermatológiai vizsgálata elengedhetetlen előfeltétele az alkalmazás magas szintű biztonságának és az ügyfelek elégedettségének. A megbízható és reprodukálható biológiai végpontok szövettani és biokémiai elemzések alapján történő meghatározásával és értékelésével megállapítást lehet tenni a terméknek a bőr regeneratív biológiai folyamataira gyakorolt hatásairól.

A 3D bőrmodell különösen alkalmas egy ilyen vizsgálatra, mivel az epidermális sejtrétegek és a dermális struktúrák természetes szövettani szekvenciáját alkotja, amint az az emberi epidermiszből ismert. A bazális réteg, a bazális keratinocita réteg közvetlenül az élő dermis egyenértéken fekszik (fibroblasztok), és szövettanilag a stratum spinosum és a stratum granulosum követi őket, amelyeket végül a stratum corneum kanos sejtrétegei borítanak.
A rendszeres epidermális cornifikáció (orthokeratosis) rendellenességei, amelyeket különféle fizikai (mechanikai, UV-A/B) vagy kémiai (SLS) ingerek okoznak, mennyiségileg és minőségileg elemezhetők és értékelhetők.

Az in vitro vizsgálatok során megvizsgáljuk:

A bőrsorompó integritása/regeneráció károsodás után,
UVA/B károsodás,
A termékek kompatibilitása.

epidermális differenciálódás,
A releváns struktúrák bőrgátja,
életerő,
A dermo-epidermális zóna integritása (DEJ),

Morfológiai-szövettani struktúrák speciális festés után,
A korneociták differenciálásában szerepet játszó fehérjék immunfluoreszcens festése,
Az interleukinek (pl. IL-1α, Il-6) mennyiségi meghatározása enzimhez kapcsolt immunabszorbens assay (ELISA) alkalmazásával,
egyéb módszerek a fejlesztésben.

Szövettani elemzés

A szövettan a biológiai szövetek tudománya (hisztosz = szövet & logók = tanítás). A szövettan segítségével a szöveti morfológiai változásokat a sejtek szintjén specifikus festéssel lehet láthatóvá tenni és ennek megfelelően értékelni. A szövettanban és a hisztopatológiában a leggyakoribb festés a H&E festés. Itt a nukleinsavak színe intenzíven sötétkék, a citoplazma és a kötőszövet rózsaszínű-vörös. Az alábbi ábra egy egészséges modell (A) és egy UVB sugárzásnak kitett, sérült modell (B) festését mutatja be.

Hematoxilin és eozin (H&E) festése ultravékony szakaszon A) kezeletlen modell B) UVB-besugárzott modell (250 mJ/cm2) 48 óra elteltével. zárt nyilak: nap égette sejteket; nyitott nyilak hidropikus sejtek (a folyadék hatalmas felhalmozódása). *: tipikus dyskeratosis (cornifikációs rendellenesség) UV-expozíció után.

A modell bemutatja a natív emberi bőr összes fiziológiai rétegét (stratum basale, spinosum, granulosum és corneum), valamint valódi cornifikációt (A). A B ábra egy 48 órás modellt mutat be UVB-expozíció után (250 mJ/cm2).
A leégés tipikus jellemzői egyértelműen felismerhetők. Számos úgynevezett "napégett sejt" (zárt nyíl), hidropikus sejtek, amelyek több folyadékot és kevésbé erős színű magot tartalmaznak (nyitott nyilak), valamint a tipikus cornifikációs rendellenesség (dyskeratosis).
Ezenkívül izolált vakuolizált keratinociták láthatók. E modell alkalmazásával a készítmény vagy egyes anyagok védelmi funkciója (napvédelme) és/vagy regenerációs képessége sejtes szinten vizsgálható és értékelhető.

A sejtosztódás sebességének elemzése

A sejtosztódás (szaporodás) sebessége fontos mutatója a szövet vitalitásának vagy „alkalmasságának”. Az emberi epidermiszben csak a bazális réteg keratinocitái (bazális keratinociták) képesek sejtosztódásra. Ezek kompenzálják a tartós hámlasztási folyamat miatt elvesztett corneocytákat, így biztosítva a szövet homeosztázisát és megakadályozva az epidermisz sejtvékonyodását.

Ultra vékony rész a teljes bőr modellből. A) fényes mező kép B) fluoreszcencia kép. Kék = sejtmagok, piros: osztódó sejtek.

A Click-It EdU® technológia alkalmazásával az epidermisz bazális keratinocitái és a dermis fibroblasztjai a sejtosztódás (mitózis) során a bőrmodellben specifikusan megjelölhetők (A + B). Ennek alapján meghatározható, hogy egy anyag vagy készítmény befolyásolja-e a sejtosztódás viselkedését egy meghatározott lokális vagy szisztémás alkalmazási és kezelési idő után.
Kezeletlen kontroll elvégzése lehetővé teszi a sejtosztódási arány százalékos számszerűsítését. Példák megnövekedett sejtosztódási aktivitásra: sebgyógyulás, gyulladásos folyamatok.

A bőr akadályainak integritása

Az egészséges bőr másik fontos paramétere az ép bőrgát, amely egyrészt megakadályozza a túlzott vízvesztést, másrészt hatékony védőpajzsot jelent a kórokozókkal, a környezeti hatásokkal és a (kémiai) káros anyagokkal szemben.

Ultra vékony rész a teljes bőr modellből. A) Kezelés steril PBS-sel B) 45 perces kezelés 1% SDS-sel.
Kék = sejtmagok, zöld: Lucifer sárga festés.

Az egyes anyagok, komplett készítmények vagy kémiai noxae hatással lehetnek a bőrsorompó integritására. Ez fokozott vízveszteséghez (fokozott párolgáshoz) és a káros anyagok felszívódásához vezethet a környezetből, amelyek (passzívan) bejutnak a bőrbe. A teljes bőrű modellben a bemutatott Lucifer sárga szín használható annak vizsgálatára, hogy egy termék befolyásolja-e a bőr gátját. A steril víz vagy PBS (foszfáttal pufferolt sóoldat) nincs hatással a gát integritására (A). A helyileg alkalmazott festék teljesen a bőr felső rétegeiben marad (stratum corneum).
Az SDS felületaktív anyaggal végzett 45 perces kezelés (1%) azonban a bőr gátjának károsodásához vezet (B). A festék behatol a bőr mélyebb rétegeibe (dermis). Ezzel a módszerrel azt is meg lehet vizsgálni, hogy egy termék képes-e helyreállítani a gátfunkciót károsodás után.