Inzulin előállítás
A cukorbetegség a civilizáció első számú betegsége. Az I. típusban a Langerhans-szigeteket az immunrendszer elpusztítja. Ez a típus 20 éves kora előtt fordul elő. A legtöbb cukorbetegnél előforduló II. Típusú (felnőttkori cukorbetegség) esetében az inzulin szintje normális vagy megnövekedett a vérben, de a hormon működési helyének változásai csökkentik annak funkcionalitását.
Rendkívül magas az inzulinigény. A géntechnológiával módosított baktériumok használata manapság könnyebb lefedni, mint korábban. A baktériumok felhasználása előtt az inzulint sertések vagy szarvasmarhák hasnyálmirigyből nyerték. A cukorbeteg körülbelül 50 sertés hasnyálmirigyét használta fel éves szükségleteinek fedezésére.
Mi a helyzet?
Megmagyarázza, hogy a béta-sejtekben mely sejt-belső folyamatok zajlanak le, amelyek aktív inzulinhoz vezetnek.
Hogyan lehet az emberi inzulint baktériumok segítségével előállítani.
Inzulin termelés emberben
Az inzulin egy nagyon kicsi hormon, amely két aminosavláncból áll (A és B lánc). Az A lánc 21 aminosavból, a B lánc 30 aminosavból áll.
Mindkét láncot először 110 AA lánc részeként szintetizálják. Ez a hosszú forma a preproinsulin.
Ennek a prekurzornak 24 aminosava jelzi az endoplazmatikus retikulum felvételét. Ez a jelsorozat felvétel közben el van osztva.
A fennmaradó 86 aminosav alkotja a proinzulint (A, B és C lánc). Az A és B lánc diszulfidhidakon keresztül kölcsönhatásba lép (-S-S-).
A C-láncot (C-peptid) ezután enzimatikusan elválasztjuk.
A C-peptid biztosítja az A és B láncok térbeli helyes illesztését (a diszulfid hidak képződése); ez az egyetlen módja az inzulin működésének.
A fehérje-prekurzor módosulása a transzláció alatt vagy után fehérjefeldolgozásként ismert.
Hogyan készítsünk emberi inzulint E. colival
1. lépés
A módosított proinsulin mRNS-t izoláljuk és reverz transzkriptázzal szintetizáljuk, így RNS-DNS hibridet képezünk.
2. lépés
A DNS polimeráz segítségével a DNS egyetlen szála elkészül. A cDNS készen áll.
3. lépés
Egy start kodon enzimatikusan kapcsolódik az inzulin cDNS-hez (A.: TAC AUG → metionin, start kodon), valamint a „ragadós végek” (B.: ragacsos végek) mellékelve.
Eredmény
A kész „utas DNS” tehát a „ragadós végekből”, a start kodonból és a B, C és A lánc proinsulin génjéből áll.
Rekombinálni - beépíteni a vektorba
Az így kapott idegen DNS-t most beépítjük a pBR322 vektorba. A vektor tartalmazza a béta-galaktozidáz gént és az ampicillinnel szembeni rezisztencia génjét.
1. lépés
EcoRI-gyel történő vágással az idegen DNS-t be kell építeni a galaktozidáz génjének közepébe.
2. lépés
Olyan „ragadós” végek keletkeznek, amelyek kiegészítik az idegen DNS-t.
3. lépés
A „ragadós” végek kölcsönhatása beilleszti az idegen DNS-t a plazmidba.
4. lépés
A réseket DNS-ligázok zárják le. A rekombinált plazmid készen áll.
Az operon jelentősége a génexpresszió szempontjából
A proinsulin génnek a galaktozidáz génbe történő beépítésével a lac operon használható a génexpresszióhoz. Ugyanakkor a galaktozidáz fehérje megvédi az inzulin komponenst a sejt saját enzimeitől, a proteázoktól, amelyek elsősorban a kisebb fehérjéket azonnal lebontják.
A modern módszerek a triptofán-szintetáz gént veszik fel a proinsulin gén felvételére, amelyet enzim represszió vezérel. A typtophan operon tartalmaz egy olyan mechanizmust is, amely triptofán hiány esetén növeli a génexpressziót, amely technikailag jól használható.
Átalakítás - Kiválasztás - Klónozás
A plazmidokat transzformációval vezetjük be az E. coli-ba. A szelekcióhoz ampicillin rezisztenciát használnak. A rekombinált baktériumok szaporodnak a fermentorokban.
Biztonsági okokból az A és B inzulinláncokat külön-külön expresszálták két különböző E. coli törzsben, hosszabb ideig, annak kizárása érdekében, hogy a baktériumok szintetizálják az emberi inzulint. Az így felszerelt baktériumok cukor sokkot váltanak ki, ha a belünkbe kerülnek.
Express - Módosítás
A génexpressziót laktóz hozzáadásával mozgásba hozzuk. A beépített inzulingénnel rendelkező béta-galaktozidáz gén expresszálódik. A galaktozidáz és a proinzulin fúziós fehérje jön létre.
A génterméket centrifugálással izolálják a tápközegből. Cianogén-bromiddal a béta-galaktozidáz részt elválasztják a proinsulintól a benne beépített metionin aminosav elpusztításával.
A proinzulint a tripszin enzimmel inzulinná alakítják. Mivel a baktériumok nem rendelkeznek a szükséges enzimmel, tisztítás után hozzá kell adni.
A baktériumok interferontermelése
Az emberi gének expressziójának jelentősége a gazdasejtekben (baktériumok, élesztők) az interferon következő példájából is egyértelmű. A rák vagy a sclerosis multiplex kezelésének hatóanyagaként csak néhány ember számára volt elérhető, mielőtt géntechnológiával módosított baktériumokkal gyártották volna. Addig az interferont a vérsejtekből nyerték. 50 000 liter vérre volt szükség 400 mg interferonhoz. Ma rekombinált E. coli sejtek felhasználásával bármilyen mennyiségben előállítható.