Lipopoliszacharid injekcióval patkányokban kiváltott szubakut agyi mikrohérzések

Összegzés

Bemutatunk egy protokollt az LPS injekció által kiváltott MHC-k kiváltására és kimutatására Sprague-Dawley patkányokban, amely felhasználható az MHC-k patogenezisének jövőbeni kutatásában.

Absztrakt

Az agyi mikrohérzések (CMH-k) gyakoriak az idős betegeknél, és korrelálnak különböző neuropszichiátriai rendellenességekkel. Az MHC-k etiológiája összetett, és a neuroinflammációt gyakran együttes eseménynek tekintik. Itt leírjuk a lipopoliszacharid (LPS) injektálásával indukált patkányok szubakut MHC-modelljét, valamint eljárást az LPS MHC-k szisztémás injekciójának detektálására. viszonylag egyszerű, gazdaságos és költséghatékony. Az LPS injekciójának fő előnye a gyulladás kiváltásának stabilitása. Az LPS injekcióval kiváltott MHC-ket durva megfigyeléssel, hematoxylin és eozin (HE) festéssel, Porosz Perl festéssel, Evans kék kettős festéssel (EB) és mágneses rezonancia érzékenységi képalkotó technológiával (MRI-SWI) lehetett kimutatni. Végül a CMH állatmodellek kifejlesztésének más módszereit, beleértve azok előnyeit vagy hátrányait is, ebben a jelentésben tárgyaljuk.

Bevezetés

Klasszikus agyi vérzés (MHC) Lásd az agy vörösvértestjeiből származó vérbontási termékek, például a hemosziderin apró perivaszkuláris lerakódásait 1. A Rotterdam Scan tanulmány szerint a 60-69 éves emberek csaknem 17,8% -ánál, a 80 évesnél idősebbeknél pedig 38,3% -nál találtak CMH-kat 2. Az MHC-k prevalenciája idősekben viszonylag magas, és összefüggést állapítottak meg az MHC-k felhalmozódása, valamint a kognitív és neuropszichiátriai diszfunkció között 3, 4. A közelmúltban számos MHC állatmodellről számoltak be, ideértve a IV típusú sztereotaxiás kollagenáz injekció által kiváltott rágcsáló modelleket 5, a transzgénikus APP-ket 6, a β-N-metilamino-L-alanin expozíciót, a 7 és a 8 magas vérnyomást, és az MHC-ket szisztémás gyulladás indukálta. az egyik elismert választás. Fisher és mtsai. 9 először a Salmonella typhimuriumból származó LPS-t használta egy akut MHC egérmodell kidolgozására. Ezt követően ugyanaz a csoport beszámolt egy szubakut MHC egérmodell fejlesztéséről, ugyanazon megközelítés alkalmazásával 2 .

Az LPS-t intraperitoneális injekcióval standardizált gyulladásos ingernek tekintik. Korábbi tanulmányok megerősítették, hogy az LPS injekció neuroinflammációt okozhat, amit a mikroglia sejtek nagy mennyisége és az asztrociták aktiválása tükröz a 2., 10. állatban. Ezenkívül pozitív összefüggést állapítottak meg a neuroinflammáció aktivációjának aktiválása és az MHC-k száma között 2, 10. Ezen korábbi tanulmányok alapján meghívást kaptunk a patkány MHC modelljének kidolgozására az LPS intraperitoneális injekciójával.

A detektálási technológiák fejlődése az MHC-ken végzett keresések számának növekedését eredményezte. A legszélesebb körben elismert MHC-detektálási módszerek magukban foglalják a vörösvértestek kimutatását hematoxilin és eozin (HE) festéssel, a vas-vas kimutatását porosz kék festésből 9, az Evans kék lerakódások detektálását immunfluoreszcens (EB) képalkotással és 7,0 Tesla mágneses rezonancia képalkotással. -Az érzékenységgel súlyozott képalkotás (MRI-SWI) 10. Jelen tanulmány célja az MHC-k szűrési módszerének kidolgozása.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az itt leírt összes módszert jóváhagyta a hadsereg Általános Kórháza PLA és Állathasználati Bizottság (ACUC).

1. anyagok

  1. Felkészülés az LPS injekcióra
    1. 25 mg desztillált vizet adunk 25 mg Salmonella typhimuriumból származó LPS porhoz, 1 mg/ml végkoncentrációig. Az injekciót steril csőben tároljuk 4 ° C-on.
      VIGYÁZAT: Az LPS mérgező.
    2. Készítsen 2% -os EB oldatot 0,9% normál sóoldatban, hogy az EB injekció működőképes legyen.

  1. Adjon LPS-t 10 hetes hím Sprague-Dawley (SD) patkányoknak (átlagos súly: 280 ± 20 g) intraperitoneális injekcióval.
    VIGYÁZAT: Ha a patkányokat egy másik szervezettől vásárolják, akkor az adaptációs szakasz nem lehet kevesebb, mint 7 nap.

3. LPS injekciók

  1. Az LPS-t intraperitoneálisan injektálja 1 mg/kg dózisban, és tegye vissza a patkányokat háziketrecükbe.
    Megjegyzés: Anesztézia nem szükséges.
  2. Hat órával később injektálja ugyanazt az LPS injekciós adagot a patkányokba.
  3. Tizenhat órával később ugyanezt az adag LPS-t fecskendezték be a patkányokba.
    VIGYÁZAT: SD patkányok LPS-vel történő injekciója 1 mg/kg dózisban 5% -os halálozási arányt eredményezhet. A halálozási arány tovább nőhet fiatalabb vagy idősebb patkányokban vagy vemhes patkányokban.
  4. Tegye vissza a patkányokat ketreceikbe az LPS beadása után, és ad libitum hozzáférést biztosítson az ételekhez és italokhoz .
    MEGJEGYZÉS: A patkányok különálló szisztémás gyulladásos választ mutatnak, ezért elengedhetetlen, hogy a ketrecek tisztaak maradjanak a kísérlet során. Az LPS első injekciója után a patkányokat gyakran (naponta kétszer) ellenőrizni kell súlyuk, általános megjelenésük és hozzáállásuk szempontjából. Ha a patkányok görnyedt testtartást, mozdulatlanságot, jelentős súlyvesztést (> 20%), porfirint festenek, emberségesen eutanizálták őket a 7. nap EB végpont vizsgálata előtt.

4. a minta

5. van színezése

Megjegyzés: Ezt az eljárást szemfoltkészlet segítségével hajtják végre.

  1. Mossa le a tárgylemezeket desztillált vízben.
  2. Foltozzuk be a hematoxilin oldatban 8 percig. folyó vízben mossuk 5 percig.
  3. Differenciáljon 1% savas alkoholt 30 másodpercig. mossa folyó vízben 1 percig.
  4. Folteltávolító 0,2% ammónia-vízzel (kékítés) vagy telített lítium-karbonát-oldattal 30 s-1 percig. folyó vízben mossuk 5 percig.
  5. Öblítse le 95% alkohollal (10 mártással).
  6. Ellenfestés eozin oldattal 30 s-1 percig.
  7. Dehidratáljon 95% alkohollal, két váltás abszolút alkoholral, mindegyik 5 perc.
  8. Tiszta xilolban 30 másodpercig.
  9. Mássz fel Liu 9. módszerével .
  10. Elemzés fényes mezővel rendelkező fluoreszcens mikroszkóppal.
    MEGJEGYZÉS: az erektől felszabadult vörösvérsejtek, amelyek az MHC-k alkotórészei, piros-narancssárga festéssel jelennek meg.