Metabolikusan aktív baktériumok azonosítása a Generalist Spodoptera littoralis bélben

Összegzés

A Spodoptera littoralis béljéhez kapcsolódó aktív baktériumközösséget stabil izotópszondázással (SIP) határoztuk meg, amelyhez piroszekvenálás társult. Ezzel a módszerrel nagy felbontással és pontossággal végezték el a metabolikusan aktív baktériumfajok azonosítását a közösségen belül.

Absztrakt

A legtöbb rovar belét nem patogén módon lakják a szimbiotikus baktériumok komplex közösségei. Ezekben a mikrobaközösségeken belül lehetőség nyílik a kölcsönös baktériumfajok azonosítására. Ez utóbbiakról megfigyelték, hogy a rovarok számára több funkciót is ellátnak, elősegítve ezzel a rovarok szaporodását, elősegítve a 2. immunválaszt, a feromontermelést 3, valamint a táplálkozást, beleértve az esszenciális aminosavak 4 szintézisét.

Ezen egyesületek fontossága miatt sok erőfeszítést tettek a közösségek jellemzésére az egyes tagokig. Ezen erőfeszítések többsége vagy tenyésztési módszereken alapult, vagy 16S rRNS-gén fragmensek előállításán alapult, amelyeket a végső azonosítás céljából szekvenáltunk. Sajnos ezeket a megközelítéseket csak a bél baktériumfajokban ismerik el, és nem nyújtanak információt a mikroorganizmusok metabolikus aktivitásáról.

A metabolikusan aktív baktériumfajok jellemzésére a rovar béljében stabil izotópszondázást (SIP) használtunk in vivo a 13 C-glükóz univerzális szubsztrátként történő alkalmazásához. Ez egy ígéretes kultúramentes technika, amely lehetővé teszi a mikrobiális törzskönyvek összekapcsolását sajátos metabolikus aktivitásukkal. Ez úgy lehetséges, hogy a mikrobiális biomarkerekben, például a DNS-ben és az RNS-ben lévő szubsztrátokból származó, stabil izotóppal jelölt atomokat nyomon követjük. A 13 C izotópok beépülése a DNS-be növeli a jelzett DNS sűrűségét a jelöletlenhez (12 C) képest. Végül a 13 C-jelölt DNS-t vagy RNS-t sűrűséggradiens ultracentrifugálással választjuk el a 12 C-jelöletlen hasonló 6-tól. A szétválasztott nukleinsav-izotópok későbbi molekuláris elemzése kapcsolatot teremt a metabolikus aktivitás és a faj azonossága között.

Itt mutatjuk be a rovar generalista (modell rendszerünk), a Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae) bélben lévő metabolikusan aktív baktériumok jellemzésére használt protokollt. A DNS filogenetikai elemzését piroszekvenálással végeztük, amely nagy felbontást és pontosságot tesz lehetővé a rovar bél baktérium közösségeinek azonosításában. A kísérletek során fő szubsztrátként 13 C-jelölt glükózt alkalmaztunk. A szubsztrátumot mesterséges táplálékkal etették a rovarokkal.

Bevezetés

A PCR-alapú szekvenálási technológiák megjelenésével növekszik azoknak a vizsgálatoknak a száma, amelyek több szervezetből (azaz emberből, rovarokból vagy tengeri élőlényekből) származó bélbiotát használják. Ezenkívül a bélben lévő baktériumok izolálásának és tenyésztésének eredményei függetlenek, mint a múltban. A baktériumok csaknem 99% -a nem tenyészthető, és nehéz szimulálni a bélben uralkodó környezeti feltételeket szekvenálva, amplifikálva, klónozva. Ezzel az információval a felhasználó azonosíthatja a baktériumfajt, miután összegyűjtötte a szekvencia információkat a nyilvános 13, 14 adatbázisokból. Ennek ellenére a baktériumközösségek leírására szolgáló szekvenálási módszerek nem megfelelőek, mivel nincsenek információk az egyes fajok metabolikus hozzájárulásáról a közösségen belül.

Itt 13 C-glükózt használunk a bélben lévő metabolikusan aktív baktériumfajok DNS-ének „jelölésére”. A glükóz a legtöbb baktériumfaj által a széles körben elterjedt Entner-Doudoroff (ED) útvonalon alkalmazott cukor, bár a 20. kivételek ismertek. Ez indokolja a 13 C-glükóz megbízható próbaként való alkalmazását, amely összeköti az érdekes metabolitokat és az anyagcserét. Szénforrás a kialakult utak mentén. A tudományos kérdéstől függően más szubsztrátok, például 13 C-metán, 13 CO 2 vagy növények 13 CO 2 atmoszférában alkalmazhatók az anyagcsere-aktivitások kezelésére.

Ezen a ponton bemutatjuk a rovar generalista, nevezetesen a S. rittoralis (Lepidoptera, Noctuidae) bélben lévő baktériumközösség metabolikus jellemzésében alkalmazott protokollt. Ezenkívül a módszert piroszekvenálással párosították, ami viszont nagy felbontással és pontossággal teszi lehetővé a rovarok bélbaktériumainak azonosítását. A kísérletek során fő szubsztrátként 13 C-jelölt glükózt alkalmaztunk.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Vásároljon vagy szerezzen be saját tenyésztelepéből Spodoptera littoralis tengelykapcsolóból származó tojásokat. Tartsuk őket steril Petri-csészékben szobahőmérsékleten (RT) a kikelésig.
2. Készítse elő a rovarneveléshez szükséges mesterséges etetést az alábbiak szerint:
   1. 500 g őrölt fehér babot áztasson egy éjszakán át 100 ml vízben.
   2. Adjunk hozzá 9,0 g aszkorbinsavat és 75 g agart 1000 ml desztillált vízhez, majd forraljuk fel.
   3. Hagyja a keveréket kihűlni, és amikor megszilárdul (fehér viaszos szilárd keverékké), felhasználásig 4 ° C-on tárolja.
3. Helyezze az újonnan kikelt lárvákat egy tiszta műanyag edénybe, és tegye a mesterséges tápláló rendszerre 23-25 ​​° C-on egy hosszú nap alatt, 16 órás megvilágítással és 8 órás sötétséggel. Minden nap cserélje az ételt, amíg a lárvák át nem mennek mind a hat lárva szakaszban.

2. A DNS 13 C-os jelölése metabolikusan aktív bélbaktériumokban

1. Oldjunk fel 186,1 mg teljesen 13 C-val jelölt glükózt desztillált és ioncserélt vízzel (ddH20), és keverjük jól össze 100 g mesterséges táplálékkal a SIP kísérlethez. Biztosítsa a 10 mM végső 13 C-glükóz-koncentrációt a mesterséges etetés során. Ez utánozza az in situ glükózkoncentrációt a S. littoralis lárvák belében pamutnövényeken Shao és mtsai. (benyújtva).
2. Körülbelül 9-15 egészséges második lárva kerül be a tenyésztőládától a steril műanyag Petri-csészékig (Petri-csészénként egy lárva), friss 13 C-glükózzal, mesterséges táplálékkal keverve. Mesterséges táplálás ugyanolyan mennyiségű natív glükózzal (12 C-glükóz), mint amit a kontrollcsoport etetésére leírtak.
3. Az inkubációs periódus alatt (1 nap) gyakran újítsa meg a mesterséges etetést. Használjon nevelési feltételeket az 1.3 lépésben leírtak szerint.
4. Minden kezelésből gyűjtsön kilenc lárvát a későbbi feldolgozáshoz (DNS-kivonás). Minden ismétlés három emberből áll, és kezelésenként legalább három ismétlést végez.

4. DNS kivonása és amplifikálása

6. DNS jellemzés piroszekvenálással

7. Piroszekvenálási adatok elemzése

1. Elemezze a 454 piroszekvenálás által létrehozott nyers szekvenciaszegmenseket a QIIME szoftver "Kvantitatív betekintés a mikrobiális ökológiába" 26 QIIME szoftver segítségével. A feldolgozást az alábbiak szerint végezze:
   1. Először konvertálja a 454 gép által előállított sff fájlt FASTA, QUAL és Flowgram fájlokká a process_sff.py forgatókönyv.
   2. Erősítse meg a leképezési fájlt (a következő alapján: check_id_map.py) és a biológiai magvakhoz rendeljen multiplex olvasmányokat a split_libraries.py Forgatókönyv. Vágja le az alacsony minőségű végeket csúszó ablakmérettel 50 és átlagos minőségi kivágással 25, és még a kétértelmű rövid szekvenciákat is kiküszöbölje (az előfizetés hossza szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t a könyvtárosának.

   Reprezentatív eredmények

   Az ultracentrifugálás után, miután az egyes frakciókban elválasztott DNS mennyiségét megerősítették, és elvégezték a sűrűségmérést, ábrázolják az átlagos frakciósűrűséget g/ml-ben a frakciószám fölött, hogy meghatározzák a csövekben a helyes meredekség-képződést, amely általában tartalmaz egy megerősítő sűrűségtartományt 1,690-től (a 12. vagy 11. frakciónál) - 1,760 g/ml g/ml-ig (az 1. frakciónál). A kvantitatív piroszekvenálást közvetlenül a reprezentatív SIP gradiensen hajtjuk végre, hogy kiderüljön a vonalfajok és a relatív bőség (2. ábra ). Itt szekvenáltuk a nehéz frakciókat mind a 13 C-glükózzal módosított mintából, mind a jelöletlen kontrollból, amely a közösség aktív populációinak profilozására szolgált. Szekvenálás után összesen 120 045 kiváló minőségű, 404 nukleotid átlagos hosszúságú leolvasás keletkezett. A piroszekvenálási profil bizonyos fajok, köztük az Enterococcus és a Pantoea megnövekedett gyakoriságát mutatta a jelzett mintában (13 C-jelölt DNS, 3. ábra) összehasonlítva a kontroll csoporthoz (12 C kontroll DNS, 3. ábra). Ezért a baktériumokat metabolikusan aktívnak kell tekinteni, és további vizsgálatokat igényelnek.

   
   1. 13 C-glükóz táplálási kísérlet, a DNS kivonása és a 16S rRNS gén PCR amplifikációja E. (A) Spodoptera littoralis lárvák által elfogyasztott 13 C-glükóz-módosított mesterséges táplálás. (B) bennszülöttek A glükóz (12 C-glükóz) lárvák mesterséges táplálásává változott ugyanabból a rovarból (A) használt, amely fogyasztott kontrollként szolgál . (C) Tipikus metagenómás DNS-kivonat a 13 C-glükóz és 12 a C-glükóz kontroll csoport lárvájának bélszövetéből. Minden csoportba három biológiai replikátum (1., 2. és 3. sáv) tartozik. M jelentése 1 kb DNS-marker. (D) A PCR-amplifikáció univerzális bakteriális primerkészlettel a megfelelő 1,5 kb méretű 16S rRNS-géntermékeket állítja elő, az templátként az extrahált metagenomikus DNS felhasználásával. Az 1. sáv a PCR pozitív kontroll. A 2. és 3. sáv állítja fel a 13 C-glükózzal kezelt mintát és a 12 C-cukor kontrollt. jpg "target =" _blank "> Kattintson ide a nagyobb nézethez.
   
   2. Pyro-SIP kísérlet megtervezése CsCl sűrűségi gradiens ultracentrifugálással és frakcióval, az elválasztott DNS piroszekvenálási jellemzésével. H = nagyobb bőség, L = alacsonyabb bőség és bőség. Kattintson ide a nagyításhoz .
   
   3. Bakteriális sokféleség és relatív bőség a natív glükóz táplált lárvák (12 C-kontroll DNS) és 13 C-glükózzal táplált lárvák (13 C-jelölt DNS) nehéz frakcióiban./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Kattintson ide a nagyításhoz.

   Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

   Vita

   Összességében az itt leírt protokoll egyszerű, gyors és hatékony módszert biztosít a bélflóra metabolikus aktivitásának meghatározására, amelyet tovább lehet alkalmazni a Bakenrial symbionts specifikus szerepének felmérésére a gazda táplálkozásában, méregtelenítésében és védekezésében.

   Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

   ---