Mitokondriális citopátiák - PDF ingyenes letöltés

Mitokondriális citopátiák A kiválasztott mitokondriális citopátiák különböző patogenezisének feldolgozása Christian Haverkamp két esettanulmánya alapján

mitokondriális

Mitokondriális citopátiák A kiválasztott mitokondriális citopátiák különböző patogenezisének feldolgozása két esettanulmány alapján. A Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen Orvostudományi Karának doktori értekezése az orvostudomány doktorának megszerzéséhez. rer. nat. Gerhard Buse egyetemi tanár úr Dr. med. J. Michael Schröder Szóbeli vizsga nap: 2008. június 13. Ez a disszertáció online elérhető az egyetemi könyvtár honlapján

Tartalom 1 Bevezetés. 4 1.1 Mitokondria. 4 1.1.1 Oxidatív foszforilezés (OXPHOS). 4 1.1.2 Reaktív oxigénfajok. 5 1.1.3 Apoptózis. 5 1.2 A mitokondriális DNS (mtdna) felépítése és szervezete. 6 1.3 Elsődleges mitokondropátia. 8 1.3.1 Az mtdna pontmutációi. 8 1.3.2 Az mtdna törlése. 11 1.4 Másodlagos mitokondriális betegség. 11 1.5 Elsődleges kardiomiopátia. 12 1.5.1 Nukleáris génhibák. 12 1.5.2 Mitokondriális génhibák. 15 2 A munka célja. 19 3 Anyag és módszerek. 20 3.1 A szövetminták eredete. 20 3.1.1 Vezérlők. 20 3.1.2 p1/p2 beteg. 20 3.1.3. P3. Beteg. 21 3.1.4 beteg p4. 21 3.2 Mitokondriális DNS előállítása. 25 3.2.1 Az mtdna izolálása a vérből. 25 3.2.2 Az mtdna izolálása az izomszövetből. 26 3.2.3 Szerves lízis. 27 3.2.4 Fenol/kloroform extrakció. 27 3.3 Gélelektroforézis. 27.

3.3.1 Agaróz gél elektroforézis. 27 3.3.2 Akrilamid-gél elektroforézis. 28 3,4 PCR. 30 3.4.1 Hagyományos PCR. 30 3.4.2 Nagy távolságú -PCR (LPCR). 32 3.5 Szekvenálás. 33 3.5.1 A DNS tisztítása. 34 3.5.2 Szekvenálási reakció. 34 3.5.3 A minták előkészítése az automatikus méréshez. 34 3.5.4 A mérés értékelése. 35 3.6 Korlátozási töredékhosszú polimorfizmus (RFLP). 35 3.6.1 MERRF: Ban-II A8344G. 35 3.6.2 MELAS: Apa-1 A3243G. 35 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G. 36 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A. 36 3.7 Megoldások és pufferek. 37 4 eredmény. 40 4,1 LHON. 40 4.1.1 Előkészítés. 40 4.1.2 PCR. 40 4.1.3 Korlátozáselemzés. 40 4.2 Kardiomiopátiák. 42 4.2.1 Mikromuszkák előkészítése. 42 4.2.2 Előkészítés. 43 4.2.3 LPCR törlés szűrés. 43 4.2.4 Szekvenálás. 45 5 Megbeszélés. 47 5.1 LHON. 47

5.1.1 Patogenezis. 47 5.1.2 Citosztatikus terápia. 51 5.1.3 Irodalom és végső értékelés. 54 5.2 Kardiomiopátia. 56 5.2.1 Intergenomikus kommunikáció. 56 5.2.2 A talált változások jelentősége. 65 5.2.3 Összegzés. 67 6 Könyvtárak. 69 6.1 Táblázatok felsorolása. 69 6.2 Ábrák felsorolása. 69 6.3 A rövidítések listája. 70 6.4 Irodalomjegyzék. 73.

1.1 Mitokondrium kromatin kondenzáció és a kromatin lebontás, amelyben a CAD is részt vesz. A mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusának (mtptp) megnyitása az elektrokémiai gradiens összeomlásához, a belső membrán duzzadásához és a külső membrán felszakadásához vezet. Úgy tűnik, hogy az mtptp az andenozin nukleotid transzlokátorból (ANT), a porinból és egyéb tényezőkből áll, mint például a Bax (BCL2-asszociált X fehérje), Bcl2 (b-sejtes leukémia/limfóma 2), a ciklofilin D és a benzodiazepin receptor. A nyitást valószínűleg a megnövekedett ROS-expozíció, a Ψ csökkenése vagy a túlzott kalciumbevitel okozza. 2-9 1. ábra: Fontos anyagcsere-utak a mitokondriumban 1.2 A mitokondriális DNS (mtdna) felépítése és szervezete A mitokondriumokat két genom irányítja. A mitokondriális strukturális és funkcionális fehérjék többségét a sejtmag kódolja, transzlálja a citoszolban és egy felismerési szekvencián keresztül szállítja a mitokondriumba. 13 fehérje alegységet, 22 trnát és 2 rrnát kódol egy mitokondriális genom. A fehérjék csak a légzési lánc részét képezik: a citokróm b, a citokróm c-oxidáz 1., 2. és 3. alegysége, a 6.

1.2 A mitokondriális DNS (mtdna) felépítése és felépítése 2. ábra: Mitokondriális genom és jellegzetes mutációk 1.3 Elsődleges mitokondropátiák 1.3.1 Az mtdna pontmutációi 1.3.1.1 A Leber örökletes optikai neuropátia (LHON) LHON a látótér központi veszteségén keresztül akutan szubakutvá válik. Főleg a középkorú férfiakat érinti. A mitokondriális DNS-ben jelenleg 18 olyan mutáció ismert, amelyek önmagukban vagy kombinációban okozzák a betegséget. 1.3.1.1.1. Klinikai jellemzők A tünetek általában középkorban kezdődnek, akut vagy szubakut fájdalommentes központi látómező vesztéssel. Fundoszkópikusan egy 8

3,6 g szövet, amely kb. 100 mg-os adagokra oszlik. Ezt a részt azután egy mikropreparátumként 26 kezelik, az egyént

3.2 Mitokondriális DNS előkészítése A mitokondriális pelleteket egyesítjük. A maxi készítményt kontroll sablonok előállítására használják. A beteg anyaga a

3.4 PCR előre- és hátramenet primerek (MWG Biotech) és 1350 µl Aqua steril. Az egyes fragmensek PCR-körülményeit az 5. és a 6. táblázat tartalmazza. A megfelelő fragmensek esetében a PCR-körülmények különböznek a hőkezelési hőmérséklet, a meghosszabbítási idő és a ciklusok száma tekintetében. Hőmérséklet Celsius-ban Idő másodpercben Első denaturáció 94 300 Denaturáció 94 30 Tann 60 hegesztés 72 kiterjesztés 72 szöveg 5. táblázat: Alapvető PCR-profil

3.6 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G A T8993C és T8993G LEIGH mutációt a 7. fragmens RFLP elemzésével detektáljuk. Az Msp-I (Gibco BRL) restrikciós mintázatát a C ^ CGG hasítási hellyel ehhez a fragmentumhoz a 3. ábra mutatja. MELAS: A3243G vad típusú MERRF: vad típusú A8344G mutáció 9205 3. ábra: A restrikciós mintázat vázlatos ábrázolása 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A Két különböző teszt áll rendelkezésre az 11778 LHON mutáció RFLP elemzéséhez. Az LHON mutáció az F10 SfaN-I restrikciójának egyik hasítási helyének, a Mae III restrikció új hasítási helyének a megszüntetését eredményezi. Mindkét vizsgálati módszer alkalmazása csökkenti a hamis negatív vagy hamis pozitív eredmény kockázatát. 36

3.6 Restriction fragment length polymorphism (RFLP) SfaN I korlátozás: GATGC 11450 997 122 12570 122 12570 LHON 11450 318 679 Vad típusú 4. ábra: LHON 11778 restrikciós minta SfaN I Mae III korlátozással: 11450 200 ^ GTNAC 125 130 58 607 12570 60750 12570 LHON 255 58 vad típusú 5. ábra: LHON 11778 restrikciós minta MAE III 3.7 oldatokkal és pufferekkel Fragment-specifikus master mix (PCR) 5,55% előreindító (8 pmol/100 µl) 5,55% reverz primer (8 pmol/100 µl) 1,11% polimerizáció -Keverjen össze 11,11% 10-szeres Taq puffert 76,66% Aqua steril hemolízis puffert 37

3.7 Oldatok és pufferek 10 mm NH4HCO3 144 mm NH4Cl H puffer 210 mm mannit 70 mm szacharóz 1 mm EDTA 5 mm HEPES (1 M oldat) 0,5% albumin töltő puffer (agaróz gélek) 15% Ficoll 50 mm EDTA 0,5% SDS 1x TBE 0,1% (m/m) bróm-fenol-kék 0,1% (m/m) xilol-cianol töltőpuffer (poliakrilamid-gélek) 98% ionmentes formamid 10 mm EDTA, pH 8,0 0,025% bróm-fenol-kék 0,025% xilén-cianol-szacharóz-puffer 250 mm szacharóz

3,7 oldatok és pufferek 10 mm TrisCl pH 7,4 1 mm EDTA SDS oldat (0,1%) 0,1% SDS 1 mm EDTA 10xTBE ​​1 M Tris-HCl 0,83 M bórsav 10 mm EDTA pH 8,3-ra állítva TE puffer 10 mm TrisCl, pH 8,0 1 mm EDTA 39

4.1 LHON Ezt az új hasítási helyet az 11778 pozícióban lévő LHON mutáció okozza. A vad típusú sávban (255 bp) nincs maradvány. L K p1 L 607 bp 255 bp 200 bp 125 bp és 130 bp 6. ábra: Agaróz gél a Mae III restrikciós fragmensek szétválasztására A p2 beteg anyja szintén hordozza a mutációs homoplazmát mindkét sejtsorban. A 7. ábra a 10. fragmens (leukocita preparátum) emésztését mutatja be az SfaN1 restrikciós enzimmel. A kontroll (K) 3 sávot mutat (679 bp, 318 bp és 122 bp). A vizsgált 10. fragmensben (p2) kihagytunk egy hasítási helyet az 11778 pozícióban; a 679 bp és 318 bp sávok hiányoznak. Ehelyett egy 997 bp sáv keletkezik. Ez az eredmény megegyezik a Mae-III emésztésével, amelyet itt nem mutatunk be. 41