Nagy áteresztőképességű Danio Rerio energiaköltség-vizsgálati protokoll (németre fordítva)
Absztrakt
Bevezetés
Az elhízás kutatásának jelenleg az egér a domináns modellje. Az egérben rendelkezésre álló rövid generációs intervallum és genetikai eszközök a mai napig páratlanok. Azonban a zebrafish-nak rövid generációs intervalluma is van (3-4 hónap), és egyszerű genetikai manipulációval is felülmúlja az egeret 1,2. A zebrafish fenntartja az emlős gének közel 90% -át, míg az egér jóval meghaladja az utódok számát és a genetikai és gyógyszeres szűrőkben való felhasználás lehetőségét 3.
A zebrafish modell elhízási vizsgálatokban rejlő lehetőségeinek kiaknázása érdekében teszteket kell kidolgozni a súlyszabályozást befolyásoló tényezők, köztük az energiafelhasználás vizsgálatára. Metabolitként az oxigén β-oxidáció útján kerül feldolgozásra, a trikarbonsav-ciklus felhasználásával elfogyasztásra kerül, és NADH 2 keletkezik. Így a NADH 2 a metabolitok metabolikus utakon (metabolitok oxidációja) keresztül történő áramlásának közvetlen mutatója. Poikilothermekben a H + szivárog a belső mitokondriális membránon, az ATP-szintézistől leválasztott NADH 2 oxidációja 4-5-ször kisebb, mint a melegvérű állatokban. csatlakoztatva. Itt leírunk egy tesztet, amely az energiafogyasztás helyettesítőjeként méri a NADH 2 termelését a zebrafish lárvákban 5.
Az oxigénfogyasztás az energiafogyasztás mérésének arany standardja. Azonban a legjobb, ha a zebrafish assay nagy áteresztőképességét használja, mivel az energiafogyasztásnak hozzáférhetőnek kell lennie a nagy áteresztőképesség érdekében. Az oxigénfogyasztó rendszereket, amelyek a zárt kamra keringési rendszertől függenek, a jelenlévő kamrák száma korlátozza az átbocsátásban A zebrafish 5.7-ben szabadtéri O 2 -fogyasztás/CO 2 -termelés vizsgálatot is alkalmaztunk. Ezek a BasisD Systems szabadtéri 96 lyukú lemezei nagy átviteli sebességgel elérhetők. Sajnos a környezettel történő gázcsere korlátozza ezen vizsgálatok érzékenységét. Nemrégiben közzétettük egy olyan vizsgálat alkalmazását, amely az alamarBlue 5 redox indikátorral figyeli a NADH 2-t. Ez a teszt leküzdi az áteresztőképesség és az érzékenység korlátait a zebrafish oxigénfogyasztás közös elemzéseiben.
A zebrafish egyre fontosabb modell az egész test energia homeosztázisának tanulmányozásában. Részben azért, mert a zebrafish a jövőben genetikai és kábítószer-szűrők segítségével érhető el. Ezenkívül a célzott genetikai manipuláció, beleértve a felárat és a bekopogást is, gyorsan alkalmazható. Korábban kimutattuk, hogy ez a teszt kombinálható a fürdõszállítással és a genetikai kiegészítéssel vagy a kiütéssel az anyagcsere sebességét módosító vegyületek és gének azonosítására 5. Ezenkívül ezt a tesztet a zebrafish-ban rejlő nagy áteresztőképességű előnyökhöz kell használni.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
MEGJEGYZÉS: Ez a protokoll követi az Arizonai Egyetem Felelős Kutatási Irodájának irányelveit, és az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság jóváhagyta
1. Zebrafish embrió tenyésztés és fenntartás
2. Készítsen tesztoldatot
- Készítsük el a vizsgálati oldatot az 1. táblázat szerint. Steril szűrő vizsgálati oldat 0,22 µm-es szűrővel. A vizsgálat megkezdése előtt melegítse a steril vizsgálati oldatot 28,5 ° C-os vízfürdőben.
| összetevő | A teljes összeg% -a | Térfogat (ul/10 ml) |
| 60x E3 embrió táptalaj | 1.667 | 166,7 |
| Kettős ionmentesített (DDI) H 2 0 | 96.233 | 9,623,3 |
| Alamar kék- | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10. |
1. táblázat Vizsgálati táptalaj
4. Értékelje a kezeléssel összefüggő relatív fluoreszcencia-változást
- A fluoreszcencia változása minden számításnál úgy is, hogy a vizsgálat végén levonjuk a 0. időpontban levő fluoreszcenciát a fluoreszcenciáról. A hal nélküli kutaknak (vakok) 0-hoz közeli értékekkel kell rendelkezniük, jóval a halat tartalmazó kutak értéke alatt.
A fluoreszcencia változása = fluoreszcencia a végén - fluoreszcencia a 0 időpontban - A fluoreszcencia relatív változásának meghatározásához számítsuk ki a kontrollfuratok átlagos fluoreszcencia-változását, majd osszuk el a fluoreszcencia változását a kontrollfuratok átlagos fluoreszcencia-változásával. Figyelemre méltó, hogy a kontrollok lehetnek hordozó kontrollok vagy genetikai kontrollok.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
Az oldat nem fluoreszcens vizsgálata embrionális halak hiányában (1) növelni. A teszt azonban nagyon érzékeny a fúrás anyagcseréjének sebességében bekövetkező kis változásokra. Egy kútban lévő egyetlen hal egy órán belül tiszta jelet ad az üres kutakból (P előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t a könyvtárosának.
Vita
A bakteriális vagy gombás szennyeződés nagymértékben korlátozza ennek a vizsgálatnak az alkalmazását. Az E3 embrió táptalajban lévő metilénkék korlátozza a gombás szennyeződés lehetőségét. Az embrió-nevelés során fontos, hogy vigyázzon az elhalt embriók eltávolítására naponta kétszer. Ezen túlmenően fontos az embriókat alaposan megvizsgálni steril E3 Embryo táptalajjal a vizsgálat megindításának napján. Ez a 2 lépés korlátozza az embriók bakteriális szennyeződésének lehetőségét. A 3.2. Lépésben leírt üres üregek beépítése lehetővé teszi a bakteriális szennyeződések kimutatását. A mérhető jelet adó baktériumszennyezés ritka. Ha azonban az üres kutak megbízható jelet mutatnak, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni, ügyelni kell az embrió tisztaságának fenntartására. Ha a felhasználó az inszemináció előtt szennyeződésre számít, az embriókat a fent leírtak szerint fehéríthetjük (22. oldal). hogy az embriókat 4 dpf-re használja (23. o.) 10.
Bár ez a teszt értékes az embriókban való alkalmazásra, felnőttkori zebrafish-ban még nem vizsgáltuk érvényességét. Arra gyanakszunk, hogy ebben a tesztben az összes funkciót korlátozná felnőtt halakban az AlamarBlue gyenge szöveti behatolása. Ezenkívül a halak táplálásakor a bélflóra olyan mély jelzést generálhat, amely a hal anyagcseréje szempontjából nincs jelentősége. Így ez a teszt az embrionális halak tojássárgájával történő etetésén alapul. Az embrionális halak relatív inaktivitása egyedülálló előnyt kínál, mivel korlátozza azt a változékonyságot, amely a tevékenység okozta energiakiadással járna 11. Tehát ez a teszt egyedülálló eszköz az anyagcsere sebességének tanulmányozására genetikai vagy farmakológiai manipulációkra reagálva egy egész állati rendszerben.
A zebrafish gyorsan vált az elhízást kísérő anyagcserezavarok vezető modelljévé. Valójában léteznek transzgenikus és étrenddel összefüggő zebrafish elhízás modellek is, amelyek közzététele 12,13. Az egérmodellekhez hasonlóan az étrend okozta elhízás a zebrafish-ban megnövelte a szérum trigliceridek és a máj lipid felhalmozódását. Az inzulin szenzibilizátor növeli az anyagcserét az inzulinkezelésre adott válaszként. Így a zebrafish ideális egész állatmodellnek bizonyulhat az inzulinérzékenységet (embrió) javító gyógyszerek felfedezéséhez és az elhízás inzulinrezisztencia (felnőttek) enyhítésének hatékonyságának megállapításához.
Az elhízott emlősökben megfigyelt fenotípusokat utánzó genetikai és étrend által kiváltott, elhízott zebrak modellek kifejlesztése ösztönzi a metabolikus betegségekre összpontosító zebra halak elindítását. Nagy teljesítményű vizsgálatok állnak rendelkezésre a zebrafish modell értékének teljes felméréséhez az energia homeosztázis tanulmányozásához. Innovatív eszközök az energiafogyasztásra összpontosító képernyők fágikus meghajtásának értékeléséhez, míg a nagy áteresztőképességű lipidtárolási tesztek az egész test lipid homeosztázisának 15-17. Az itt leírt teszt egy nagy áteresztőképességű eszköz a gének, vegyületek vagy azok kölcsönhatásainak az egész test energiafelhasználására gyakorolt hatásának értékelésére.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.