PDF VIZSGÁLATOK A GLUKÓZMETABOLIZMUSRÓL - Ingyenes letöltés PDF
Rövid leírás
1 55 VIZSGÁLATOK A GLUKÓZMETABOLIZMUSRA A. BIOKÉMIAI ALAPOK Egészséges embereknél a vércukorszint.
Leírás
A GLUKÓZMETABOLIZMUS VIZSGÁLATA.
A krónikus májbetegségek a kontra-inzulin hormonok túlsúlya miatt fordulnak elő vagy okozzák (például akromegáliában, Cushing-kórban, feokromocitómában). A cukorbetegség elsődleges formái két fő csoportra oszlanak, nevezetesen az I. típusú cukorbetegségre, az úgynevezett fiatalkori cukorbetegségre, amelynek oka ma feltételezhetően immunológiai tényezők, amelyek a B-sejtek pusztulásához, és ezáltal inzulinhiányhoz vezetnek, másrészt II Cukorbetegség (felnőttkori cukorbetegség), amelynél más, részben még ismeretlen mechanizmusok meghatározóak. Ez általában nem inzulinhiányt eredményez, hanem inkább inzulinhatás csökkenését eredményezi, például az inzulinreceptorok hiánya miatt. Különösen a II. Típusú cukorbetegség esetén, amely hosszabb idő alatt lassan haladhat előre, és így észrevétlen marad, a betegség előrehaladása megelőzhető, ha az elhízás, a lipidanyagcsere rendellenességei, a fizikai inaktivitás és az inzulinellenes hormonok túlsúlyának kockázati tényezőit kezelik. A detektálásban fontos szerepet játszik a gyakorlaton végzett glükóz tolerancia teszt.
Az I. típusú cukorbetegségben az immunológiai szűrővizsgálatok (a szigeti sejtek egyes részei elleni antitestekre) nagyobb szerepet játszanak a jövőben, mivel jóval a betegség megjelenése előtt jelennek meg, ami általában a beteg számára hirtelen következik be. Ezen a ponton azonban a szigeti sejtek 80% -a általában már elpusztult. Is
A vércukorszint állandó szinten tartása szigorú anyagcsere-ellenőrzés (inzulin, étrend, testmozgás) révén a másodlagos betegségek, például az arteriosclerosis, a vakság, a vesekárosodás, a gangréna és a neuropathiák késleltetése érdekében. Ehhez fontos segítség a szakmai gyakorlaton végzett glikozilezett hemoglobin meghatározása. A kontrollálatlan cukorbetegségben szenvedő betegek vércukorszintje gyakran magas a plazmában. Ez a glikált hemoglobin koncentrációjának növekedéséhez vezet az eritrocitákban. Normál vércukorszinttel rendelkező egészséges egyének eritrocitái teljes hemoglobinjuk 4-7% -át tartalmazzák glikozilált formában. Rosszul vagy rosszul kontrollált cukorbetegeknél ez az érték elérheti a 18-20% -ot. A glikozilezett hemoglobin meghatározása lehetővé teszi a vércukorszint hosszú távú megfigyelését. Ha módosult, a hemoglobin addig marad a véráramban, amíg az eritrocita életben van (kb. 120 nap). A glikált hemoglobin emelkedett szintje csak a glükózszint beállítása után 5-6 héttel kezd csökkenni, és kb. 20 hét után eléri a normális tartományt.
Jelzi a vér glükózkoncentrációját, a glikált hemoglobin koncentrációja egyfajta integrált jelent a vércukorszinthez képest néhány hétig.
Glükóz tolerancia teszt A glükóz tolerancia tesztben a vércukorszintet orális glükóz expozíció után 1,5 órán keresztül mérik, és annak időbeli lefolyását összehasonlítják egy szokásos kollektívéval. A Langerhans-szigetek B-sejtjeinek funkcionalitásának ezen közvetett tesztje mellett komplex immunológiai technikákkal közvetlenül meghatározható az inzulin-koncentráció időbeli alakulása is a szérumban. Egészséges egyéneknél (normális kollektív) vagy cukorbetegeknél a glükóztolerancia-vizsgálattal megfigyelt vércukor-koncentráció növekedést és csökkenést az I. táblázat mutatja. Tünetmentes diabetes mellitus gyanúja merül fel, ha túllépik a 30-60 perc múlva várható 11,1 mmol/l értéket. A 2 órás érték diagnosztikailag értékesebb; ha 7,8 mmol/l fölött van, akkor cukorbetegségről van szó. Ezzel szemben a maximális értékek 8,9 mmol/l alatt és két órás értékek alatt
6,7 mmol/l a normál tartományban. A köztes tartományban lévő értékek gyanúsak és ellenőrizni kell őket. Annak érdekében, hogy provokációs teszttel ne veszélyeztessük az esetleg cukorbeteg pácienst, a nyilvánvaló cukorbetegséget előzetesen kizárják a "napi vércukor-profil" segítségével.
Az orális vércukorszint-expozíció értékelése glükóz beadása után A vércukor-koncentráció a kapilláris vérben mmol/l 0 '
A glükóz-tolerancia teszt felhasználható a különféle okokból eredő kóros hipoglikémia (funkcionális hiperinsulinizmus, szigetsejtes adenoma) kimutatására (és kiváltására) is, amelyben az orális glükóz beadása után a maximális érték a normálérték alatt marad. Az elsődleges diabetes mellitus négy szakaszra osztható: 1.
Potenciális cukorbetegség: nincs diabéteszes anyagcsere, a cukorbetegség szűrővizsgálata normális, de családi terhelés; népességünk kb. 25% -a
Látens cukorbetegség: stressz, terhesség vagy túlsúly esetén a glükóz tolerancia teszt is pozitív lehet.
Tünetmentes ("szubklinikai" vagy "kémiai") cukorbetegség: glükóz tolerancia teszt pozitív; a lakosság mintegy 8% -a.
Klinikai cukorbetegség: nyilvánvaló cukorbetegség; a lakosság mintegy 3% -a. Hiperglikémia és esetleg glükózuria. A cukorbetegség szűrővizsgálata nem szükséges. Ebben az esetben a vizsgálatok veszélyeztethetik a beteget!
Glikált hemoglobin A glikált hemoglobin a glükóz nonenzimatikus hozzáadásával jön létre a peptidláncban lévő lizin aminocsoportjaihoz vagy a és alegységek N-terminális végéhez. Az eritrocita membránban lévő glükóz transzporter biztosítja a glükóz gyors cseréjét, így az eritrocitákban ugyanaz a glükóz koncentráció van jelen, mint a plazmában. Az aldózisok szabad aminocsoportokkal reagálva Schiff-bázist képeznek. Amadori átrendeződéssel a glikozilmaradék visszafordíthatatlanul kovalensen rögzül a második lépésben (1. ábra).
A glikált hemoglobin (HbA1) specifikus meghatározása a hemolizátumban a hemoglobin-frakciók előzetes elválasztása után lehetséges ioncserélő kromatográfiával. Ez a szétválasztási folyamat azon ionok elektrosztatikus kölcsönhatásán alapszik, amelyet a vizsgálandó minta egy ioncserélővel tartalmaz, amely ellentétes töltésű csoportokat tartalmaz, amelyek kovalensen rögzülnek egy oldhatatlan hordozóanyaghoz (mátrixhoz). Az ioncserélővel kölcsönhatásba lépő ellenionok kicserélhetők más, azonos töltésű ionokra. Az ioncserélő töltetétől függően az ioncserélők),
Ioncserélők) negatív töltéssel. Szinte az összes fehérjéhez hasonlóan a hemoglobin is elektromos töltést hordoz vizes oldatban, amelyet az aminosav oldalláncok savas vagy bázikus csoportjai, valamint a terminális amino- és karboxilcsoportok okoznak. A molekula nettó töltése a pozitív és negatív egyedi töltések összegéből adódik, és függ a fehérje oldat pH-értékétől. Az a pH, amelynél a pozitív töltések száma a
negatív és amikor a molekula kifelé töltötlennek tűnik, izoelektromos pontnak nevezzük. Az izoelektromos pont (IP) alatt a molekula töltése pozitív (kation), ezért megköthető egy kationcserélőhöz, míg az IP felett nettó negatív töltés (anion) található, amely lehetővé teszi a fehérje számára, hogy egy anioncserélőhöz kötődjön. A fehérje és az ioncserélő közötti elektrosztatikus hatás a pH-érték megváltoztatásával vagy a sókoncentráció (kompetitív ionok) növelésével gyengülhet, sőt teljesen feloldódhat. Ebben a kísérletben gyengén savas kationcserélőt használnak a hemoglobin különböző részfrakcióinak elválasztására. A hemoglobin alikvot részét ioncserélő szuszpenzióval keverjük össze. A választott körülmények között (pH = 7,0) csak a normál hemoglobin kötődik, míg a glikozilezett hemoglobin (HbA1) a felülúszóban marad. A kettő eltérő adszorpciós viselkedése
glikozilezett és normális hemoglobin, amelyet a glükóz visszafordíthatatlan kötése hoz létre a fehérje aminocsoportjához, változatlan pH-értékkel, teljes töltését a negatív tartomány felé tolva, és ezáltal csökkentve a glikozilezett hemoglobin és az ioncserélő közötti kötőerőket.
Általános kérdések a glükóz metabolizmusáról; A vércukorszint szabályozása; Az inzulin és az inzulinantagonisták hatása; Az említett hormonok kémiája; Metabolikus változások a diabetes mellitusban; Hemoglobin (szerkezet, funkció, oxigénkötési görbe, Bohr-hatás, pufferhatás, kóros változások: mennyiségi és minőségi hemoglobinopátiák, sarlósejtes hemoglobin); Myoglobin.
A KÍSÉRLETEK CÉLJA
Glükóz tolerancia teszt Miután a vizsgált személy meghatározott mennyiségű glükózt szedett szájon át, a vér glükóz koncentrációja gyorsan emelkedik, miután a glükóz felszívódott a bél lumenéből. A vércukor-koncentráció a testmozgás megkezdése után egy bizonyos idő alatt normalizálódik. Ezt a folyamatot követni kell a kapilláris vér glükózkoncentrációjának meghatározásával. A vércukor-koncentráció megfigyelt növekedését és csökkenését grafikusan kell bemutatni, majd értelmezni kell.
Glikált hemoglobin meghal
kereskedelemben kapható reagenskészlet, amely gyengén savas kationcserélő használatra kész szuszpenzióját tartalmazza. A cél a glikozilezett hemoglobin mennyiségének meghatározása a saját vérében, valamint a megnövekedett értékű mintában (diabéteszes vér).
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS ÉS VIZSGÁLATI JEGYZŐKÖNYV
Hozza lista: smock, számológép
Készítsen elő öt Eppendorf-csövet egyenként 0,5 ml perklórsavval (0,35 mol/l). 30, 60 és 90 perc elteltével 0,05 ml kapilláris vért veszünk ki az ujjbegyből egy kapilláris pipetta segítségével, és a kapillárt perklórsavval az Eppendorf-csövekbe helyezzük, és alaposan megrázzuk (fehérítésmentesítés!). Miután 0,05 ml kapilláris vért vett az éhomi vércukorérték meghatározásához (1. minta), a vizsgált személy 75 g glükóz 300 ml lében készült oldatát issza. Az idő naplózásra kerül. 10 perccel az utolsó minta eltávolítása és perklórsavval történő fehérjementesítése után 4 percig centrifugáljuk maximális sebességgel. A felülúszókat gondosan dekantáljuk, új Eppendorf-csövekbe visszük és 4 percig újra centrifugáljuk. A felülúszókat a vércukorszint meghatározására használják (C.3. Szakasz). Kérjük, jelölje meg az edényeket a csoportszámmal, valamint a minta számával, és a fennmaradó mintákat adja át az asszisztensnek a vizsgálat után!
Glükózreagens: A glükóz-oxidáz (GOD) H2O2 képződésével oxidálja a glükózt glükonsavvá. A hidrogén-peroxid oxidálja a hidrogén donort (fenolt és 4-amino-fenazont) D festékké a peroxidáz (POD) által katalizált reakcióban:
ISTEN glükóz + H2O + O2 glükonsav + H2O2
A képződött D festék mennyisége az átalakult glükóz mennyiségének mértéke. Mivel a D moláris extinkciós együtthatója a vizsgálati körülményektől függ, a mért extinkció (500 nm hullámhossz) a glükóz standard értékének kihalásával függ össze.
A vércukorszint-meghatározás elvégzése
A szükséges megoldások a munkaasztalon találhatók: I:
Glükózreagens-foszfátpuffer, 0,10 mol/l, pH = 7,0; 50 ug kromogén (0,75 mmol/l fenol és 0,25 mmol/l 4-amino-fenazon); > 1,5 KU/l POD; > 15 KU/l ISTEN; > 2,0 KU/l mutarotáz
Glükóz standard (5,55 mmol/l).
A glükózszint 50 µl-ét hígítsuk 0,5 ml perklórsavban. Az előkészített mintákkal (C.1. Szakasz) készítse elő az adagokat az alábbi táblázat szerint, alaposan keverje össze és hagyja állni 10 percig szobahőmérsékleten.
Kalibráljuk a fotométert 500 nm-en, határozzuk meg a standard és a minták abszorbanciáját a vak értékhez képest.
Glikált hemoglobin 1.
Vérvétel és a hemolizátum elkészítése: Helyezzen 200 µl hemolízis-reagenst egy E-jelzéssel ellátott Eppendorf-edénybe (Eppi); Gyűjtsön vért egy 50 µl kapilláris pipettával; A megtöltött hajszáleret azonnal tegye az Eppi-be, és jól keverje össze, hogy a vér kiürüljön; Hagyja állni 5 percig.
HbA1 megközelítés A megközelítéseket párhuzamosan állítják be a standard vérből (Eppi "S"), az autológ vérből (Eppi "E") és a cukorbeteg vérből (Eppi "D") származó hemolizátumokkal. Erősen rázza meg a hemolizátumot pipettázás előtt! Pipettázzon 100 µl hemolizátumot az ioncserélő csövekbe; Jelölje meg a csöveket ("S", "E" vagy "D"), és helyezzen be elválasztókat (hagyja körülbelül 1 cm-rel a folyadék felett); Inkubáljuk 5 percig, és erőteljesen rázzuk egy percenként; Óvatosan nyomja össze a folyadékot a szeparátorral és mérje meg az abszorbanciát [ 4. pont (E1)].
Összes Hb tétel Három párhuzamos tételben 20 μl "S", "E" vagy "D" hemolizátumot teszünk egy kémcsőbe 5 ml desztillált vízzel. vegyes. (Ne felejtsd el a betűket)! Hagyjuk állni 5 percig, majd mérjük meg az abszorbanciát [ 4. pont (EG)]
A vérminták extinkciós mérése = 405 nm-en (a fotométert vízhez igazítjuk).
Glükóz tolerancia teszt (a kísérlet lefolytatása) Összefoglalás Azonnal hajtsa végre az 1-4. Pontot, majd olvassa tovább ! 1. kísérlet 1) 2) 3) 4)
Adjon 500 µl perklórsavat 4 Eppis-hez (0,30, 60,90 perc jelzéssel), és vegyen vizet. Ehhez használjon kapillárt. (A kapillárisnak tele kell lennie, nincs légbuborék) Dobja a kapillárisot a „0 perc” feliratú edénybe, és azonnal rázza össze. Igyon kólát, írja le az időt.
2. kísérlet: Bármikor elvégezhető (az 1. kísérletből származó 30 vagy 60 perc megfelelő idő).
B rész) 21) Töltsön meg három kémcsövet mindegyikbe 5 ml vízzel („E”, „S”, „D” felirattal). 22) Az Eppis-ből („E”, „S”, „D”) egyenként 20 µl hemolizátumot. a kémcsöveket vízzel feltöltve
adni. 23) Keverje össze jól, és hagyja állni 5 percig. 24) Mérje meg ismét az abszorbanciát 405 nm-es vízzel szemben.
Tisztítás után ne dobja ki a glükóz-standardot, a glükóz-reagenst és a hemolízis-reagens csöveket. Az összes többi mintatartályt a mellékelt véredényekben kell elhelyezni.
ÉRTÉKELÉS ÉS HIBAVITÁS
Glükóz tolerancia teszt Írja be a mért abszorbancákat és a glükóz meghatározás eredményeit a következő táblázatba, és rajzolja meg a görbét. Hogyan értelmezi az eredményeket?
E500 vércukor-koncentráció (mmol/l)
A vércukor-koncentrációt a következőképpen kell kiszámítani:
Glikolizált hemoglobin Írja be a mért abszorbanciát a következő táblázatba, határozza meg az F tényezőt, és számítsa ki a HbA1 frakció százalékos arányát az autológ és a diabéteszes vér teljes hemoglobinjában. A standard vér HbA1 aránya 6,8%.