Prot; ines

Fehérje. Tisztítás (gyakorlatok)

A fehérjetisztítás számos technikát foglal magában a kromatográfiában, a sókiválásban, az elektroforézisben és a centrifugálásban.

1. kérdés.
Mi az oka annak, hogy az ammónium-szulfátos kicsapást kezdeti fehérjetisztítási lépésként alkalmazzák?
(1. válasz)

Válaszok. Részletek Válasz az 1. kérdésre (1. kérdés)
Az ammónium-szulfátos kicsapás (frakcionálás ammónium-szulfáttal, kisózás) a fehérje oldhatóságának kritériumát használja. Lehetővé teszi a kérdéses fehérje koncentrálását azáltal, hogy a teljes kivonatban található fehérjék általában nagy részét nem specifikus módon kicsapja. Nyers fehérje nyers extraktumot (részleges tisztítást) kapunk, amelyet további tisztítási lépéseknek vethetünk alá.

Válaszok. Részletek (folytatás) Válasz a 2. kérdésre (2. kérdés)
Az ioncserélő gyantára kötött fehérjék eluálásához két lehetőség kínálkozik: 1/használjon pH-értéket vagy sógradienst (általában NaCl). Ha a NaCl-gradiens alkalmazását választjuk, akkor általában egy alacsony ionerősségű pufferrel kezdjük, majd egy sor pufferrel, amelynek NaCl-koncentrációja fokozatosan növekszik (folyamatos gradiens-előállító használható). A Na + vagy Cl- ionok leválasztják a fehérjéket az oszlopról azáltal, hogy semlegesítik a negatív vagy pozitív töltéseket, amelyek lehetővé teszik a fehérjék számára, hogy kölcsönhatásba lépjenek a gyantával. Az eredmény a fehérjék töltéssűrűségük szerinti eluálása. Valójában ahhoz, hogy a kationcserélő oszlopról (CM-cellulóz) leválasszák, a kevesebb pozitív töltésű fehérjékhez kevesebb Cl-ionra (tehát alacsonyabb NaCl-koncentrációra) van szükség a töltésük semlegesítéséhez, mint a több pozitív töltésű fehérjékhez. Ugyanez a logika vonatkozik a Na + -ionokra az anioncserélő gyantához (DEAE-cellulóz) kapcsolt fehérjék eluálása során.

Válasz kérdésre kérdés

E gyakorlat esetében arra következtethetünk, hogy:
- a mioglobin először eluálódik, mivel nem kapcsolódik az oszlophoz (pH =

- az ureáz pl (5.4) közelebb van a puffer pH-jához, mint az ovalbumin (4.6) pl: az ureaznak így kevésbé negatív a teljes nettó töltése, mint az ovalbuminnak. Megjósolhatjuk tehát, hogy az ureáz alacsonyabb NaCl-koncentrációval eluálódik, mint az ovalbumin eluálásához szükséges.