Proteoliposzóma-alapú effluxvizsgálat a Cl-csatornák és az egyes molekulák tulajdonságainak meghatározásához
Bevezetés
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
1. Lipidek előállítása
2. Proteoliposzóma képződés
MEGJEGYZÉS: Számos stratégia alkalmazható a detergens szolubilizált fehérje bevitelére a liposzómákba. A CLC-ec1 esetében a dialízis jól működik, ezért a 6,9,10 választott módszer.
3. Felvétel beállítása
MEGJEGYZÉS: A regisztráció be van állítva (2A. ábra) két kamrából áll (lapos fenekű hengerek,
3-4 ml térfogat), Cl - (lásd alább) elektróda, pH-mérő analóg vagy digitális elektromos kimenettel, digitalizáló és számítógép a megfelelő beszerző szoftverrel.
- Csatlakoztassa a Cl - pH-mérő elektródát, a pH-mérő kimenetét a számítógéphez csatlakoztatott digitalizálóhoz. Helyezze a referenciaelektródot az egyik újrakódoló kamrába, a huzalt a másikba (2B. ábra).
MEGJEGYZÉS: A vezetékek polaritása akkor helyes, ha az AV Cal (lásd 6.4 és 7.2 lépés) pozitív. - Helyezze a kamrákat egy keverőlapra egy keverőkarral a rögzítő kamrában (1B. ábra). Ügyeljen arra, hogy a keverőléc ne érjen az elektródához.
- Csatlakoztassa a kamrákat egy agar híd segítségével (2B. ábra) (100 mM KCl és 2% agaróz). Tárolja az Agar-hidakat 100 mM KCl-ban.
4. Cl - elektróda előkészítése
- Vegyünk egy régi és - valószínűleg - nem működő pH-elektródot. Törje meg az üvegbevonatot, hogy teljesen felfedje az ezüst szálakat.
- Szike segítségével óvatosan távolítsa el a bevonatot az ezüsthuzalokról. Tisztítsa meg a vezetékeket nagy mennyiségű vízzel és etanollal.
- Helyezzük telített FeCl 3-oldatba (vagy fehérítőbe), amíg a huzalokat egyenletes sötét AgCl-réteggel nem fedjük le.
5. Unilamelláris vezikulák előállítása
-
A kísérletek előtti este 1 g Sephadex G-50 gyöngyöt 15 ml külső pufferben (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citromsav, pH 4,5) duzzasztunk meg enyhe rázással. (Ne keverjük) használat előtt legalább három órán át szobahőmérsékleten. Minden tapasztalat megköveteli
3 ml duzzadt gyöngy. A gyöngyöket legfeljebb néhány napig 4 ° C-on duzzasztva tartsa. Amíg a liposzómák szobahőmérsékleten olvadnak, öntsük mindegyik oszlopba
3 ml felfújt G-50 gyöngy. Hagyjuk szobahőmérsékleten gravitációs úton száradni; általában 1-2 percet vesz igénybe.
200 láb akkreditív, amelyet a 6.5 lépésben hozzáadnak a felvevő kamrához.
6. Kifolyásmérés
- Helyezzen 2 ml 100 mM KCl-ot a referencia (tömeg) kamrába, és 1,8 ml külső puffert (1 mM KCl, 150 mM K2S04, 25 mM citromsav pH = 4,5-nél) a rögzítő kamrába. A belső és külső megoldások közötti enyhe ozmotikus egyensúlyhiány nem befolyásolja
- Indítsa el a beszerzési programot. Hagyja az alapegyensúlyt, ez eltarthat néhány percig.
- Amint a jel eléri a stabil alapvonalat (a liposzómák készen állnak és az oszlopok kiszáradnak), kezdje el a felvételt (3A. ábra).
- Adjon hozzá 15 µl 10 mM KCl-oldatot a rendszer kalibrálásához (2A. ábra).
- Adjon hozzá liposzómákat. Egy kis ugrás látható lehet a külső Cl - proteoliposzómák hiányos eltávolítása miatt (3A. ábra). Várja meg, amíg az alapvonal stabilizálódik.
- Adjon hozzá valinomicint (1 µl 1 mg/ml koncentrációban EtOH-ban) a kiáramlás megindításához (3A. ábra).
- Hagyja, hogy a kiáramlás az evolúcióját az idő múlásával egyenletessé tegye (3A. ábra).
- Adjunk hozzá 40 µl 1,5 M β-oktil-glükozidot (β-OG), amelyet az összes liposzóma feloldásához külső pufferben készítettünk (3A. ábra). Teljes regisztráció.
7. Adatelemzés
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
1/3-a 0 aktív fehérjét tartalmazó liposzómákat tartalmaz. Ezekből az értékekből kiszámoljuk, hogy az egység szállítási sebessége γ
2500 Cl - sec -1, jó egyezésben a közzétett értékekkel 8.14.
