Rekombináns fehérjék részecskekészítményeinek előállítása fluid ágy segítségével - PDF
1 értekezés a Ludwig-Maximilians-Universität München Kémiai és Gyógyszerészeti Karának doktori fokozatának megszerzéséhez Rekombináns fehérjék részecskékből álló készítményeinek gyártása fluid ágy segítségével Matthias Ganz Würzburgból 2007
8 TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés Fehérje részecskék előállítása fluidizált ágy Eszközparaméterek Folyamat paraméterek Szárítás ellenőrzése Fehérje szárítás fluid ágyban Alternatív eljárások a fehérje részecskék előállításához Permet szárítás Fagyasztva szárítás Spray fagyasztva szárítás Csapadék Szuperkritikus folyadékok Röntgen fotoelektron spektroszkópia a gyógyszertárban Alapvetések Prototípusok kvalitatív elemzése és prototípus-analitikai módszerek emberi interleukin anyagok fluid ágyas folyamatokhoz más anyagok 24
9 TARTALOMJEGYZÉK 3.2. Folyamatrendszerek GPCG-1 rendszer Mini-Glatt rendszer Analitikai módszerek Az rhil SE-HPLC jellemzése aggregátumok elemzésére RP-HPLC a rokon fajok elemzésére RP-HPLC az oxidált metionin gél elektroforézis (SDS-oldal) elemzésére Lézer diffrakció Karl-Fischer polarimetria DSC XPS UV-spektroszkópia BET felületmérés Eredmények és megbeszélés Összehasonlító tesztek különböző rendszerekben Tesztek a GPCG-1 rendszerben Tesztek a Mini-Glatt rendszerben Összefoglalás A Mini-Glatt rendszer optimalizálása Süllyesztett fúvóka Módosított anyagból készült tartály és fúvókatartó 53
10 TARTALOM További optimalizált anyagtartály Mini-Glatt rendszer mikrokészlettel Összefoglalás A rhil-11 készítmények stabilitása Hordozóanyagok és permetoldatok stabilizáló adalékok nélkül Hordozóanyagok és permetoldatok trehalóz adalékkal MCC-Spheres és permetoldatok PS80 adalékkal Hozzáadott cukor hatása 0,02% PS-vel kombinálva Az rhil-11 termékek XPS összefoglalása A hordozóanyagok spektrumai, a trehalóz és a rhil XPS elemzése az rhil-11 bevonattal ellátott hordozókról Loading A fedettség kiszámítása az XPS elemzések alapján A modellek értékelése Összefoglaló irodalom 125
11 Rövidítések kötelező energia BET Brunnauer, Emmet és Teller BSA szarvasmarha szérum albumin DMSO dimetil-szulfoxid DSC differenciális pásztázó kalorimetriás FD fluidizációs nyomás FD fluidizációs nyomás GPCG-1 Glatt Részecske Coater granulátor-1 IR infravörös KAD konfiguráció leengedett fúvókával LDH laktát-dehidrogenáz MCC mikrokristályos cellulóz nátrium-nátrium-nátrium-IR Nemzeti Szabványügyi Intézet PS80 poliszorbát 80 rhgh rekombináns emberi növekedési hormon rhil-11 rekombináns humán interleukin-11 RP-HPLC fordított fázisú HPLC RS rokon fajok SD permetezési nyomás SDS nátrium-dodecil-szulfát SE-HPLC méretkizárásos kromatográfia SK standard konfiguráció WS fluidizált ágy XPS röntgen fotoelektron spektroszkópia
21 1 BEVEZETÉS 10 Elért 40 nm (Thiering és mtsai; 2000a). A kicsapódás további fejlődése a fehérjeoldat szuperkritikus folyadékkal történő edénybe történő permetezése, a porlasztás során keletkező felület miatt a fehérjerészecskék néhány másodpercen belül megjelennek. Ezzel a technológiával egyenletes alakú és keskeny méreteloszlású részecskék állíthatók elő (Palakodaty et al.; 1999; Yeo et al.; 1993). A szuperkritikus folyadéktechnikában a fehérjerészecskék tulajdonságai, például a részecskeméret-eloszlás és a morfológia, többek között a szuperkritikus folyadék hőmérsékletétől és nyomásától függenek (Jung és mtsai; 2001). Hátránya az összetett folyamat és az eljárás magas költsége.
2 2. CÉLKITŰZÉS 3) Ezt követően megvizsgálják a különböző hordozóanyagok és a különböző permetoldat-adalékanyagok, például a cukor, a felületaktív anyagok vagy az antioxidánsok hatását az rhil-11 fizikai és kémiai stabilitására mind a folyamat, mind a tárolás során. Oldhatatlan MCC-gömböknél a permetoldat-adalékok hatását a hordozóanyag oldhatósági hatásaitól függetlenül kell vizsgálni. 4) A hordozó fehérje vagy fehérje mátrix felületének jobb megértése fontos magyarázatokat adhat a fehérje instabilitására, mivel a fehérjék denaturálhatók a felületeken. Az XPS segítségével meg kell vizsgálni az rhil-11 eloszlását a részecskefehérje készítmények felületi/felszínközeli rétegein.
34 3 ANYAG ÉS MÓDSZEREK 23 3 ANYAG ÉS MÓDSZEREK 3.1 ANYAGOK, A KÖZÖSSÉGŰ HUMÁN INTERLEUKIN-11 Minden kísérlethez fagyasztott vizes oldatot használtunk, kb. 15 mg/ml rhil-11, 6 mM nátrium-monofoszfát, 4 mM nátrium-difoszfát és 300 mM glicin, pH 7,0 ( Wyeth BioPharma, Andover, USA). Bizonyos kísérletekhez az ömlesztett készítmény glicinjét foszfátpuffer oldat (10 mM, ph = 7) elleni dialízissel távolítottuk el. Spectra/Por 7 típusú dialízis csövet alkalmaztunk, 3000 MWCO-val a Spectrum Medical Industries Inc.-től (USA). SEGÉDANYAGOK FOLYÓSÍTOTT ÁBRAS KÍSÉRLETEKHEZ Tab: Segédanyagok fluid ágyas vizsgálatokhoz Anyag Leírás Beszállító forrás MCC-gömbök (Cellets 100) 98,2% = µm Pharmatrans Sanaq AG MCC-gömbök (Cellets 200) 98% = µm Pharmatrans Sanaq AG szacharóz RFF cukor Südzucker Trehalose dihidrát Georg Breuer GmbH D-mannit (Pearlitol 200SD) 98,% EP Roquette D-Mannitol (Pearlitol 300DC) 98,% EP Roquette glicin 99,0-101% Rexim (Degussa) dinátrium-hidrogén-foszfát-heptahidrát Merck, Darmstadt-nátrium-dihidrogén-foszfát-monohidrát Merck, Darmstadt-metionin Fluka, Buchs, Svájc
35 3 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK EGYÉB ANYAGOK Tab: További anyagok Anyag Leírás Beszerzési forrás Acetonitrile HPLC minőség, Fisher Scientific,> 99,9% Leicestershire, Egyesült Királyság Ammónium-nitrát> 99% Grüssing, Filsum kolloid kék festékkészlet A és B festőberendezés de Häen, Seelze Mark12 TM Molecular Standard for Invitrogen, Karlsruhe Gel elektroforézis metanol HPLC minőség,> 99,8% Merck, Darmstadt Metionine Fluka, Buchs, Svájc Morfolinoetánszulfonsav (MES)> 99,5% Sigma, Steinheim-nátrium-klorid ACS,> 99% Sigma, Steinheim nátrium-dodecil-szulfát elektroforézis minőség,> 99% Roth, Karlsruhe nátrium-hidroxid pelletek pa> 99% Merck, Darmstadt MOPS-ot, NuPAGE MOPS futó Tris Base-t, SLS, puffer EDTA Invitrogen, Karlsruhe tartalmaz glicerint, Tris bázist, tris NuPAGE LDS mintát; EDTA, Invitrogen, Karlsruhe Buffer Serva Blau 250, Phenol Rot, Wasser NuPAGE redukálószer O, 5M DTT Invitrogen, Karlsruhe PS80 Crillet HP, nagy tisztaságú Croda, Netteta 1 trifluor-ecetsav Sigma, Steinheim
36 3 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK FELDOLGOZÓ ÜZEMEK GPCG-1 NÖVÉNY A folyamat vizuális jobb követése érdekében a vizsgálatokat alapfelszereltségként a felső permetező elrendezésben hajtottuk végre, két anyagú, 1 mm belső átmérőjű fúvókával. A szövetszűrő zsákokat kétkamrás módszerrel rázzuk le. A standard paraméterek a fülön vannak felsorolva. Fül: Normál paraméterek GPCG-1 Kísérletek: Folyamatparaméterek, permetoldat, hordozóanyag Folyamatszabályozási paraméterek Érték (egység) Folyadéklevegő sebessége 1,5 m/s Permetezőnyomású fúvóka 1,9 bar Adagolási sebesség permetlé 2,8 g/perc Belépő hőmérséklet 30 C Rázási intervallum (szűrő) 10 másodpercenként (aszinkron) ) Rhil-11 permetlé 2,5 mg/ml foszfátpuffer 10 mM, ph = 7,0 glicin 300 mM permetlé mennyiség 250 g hordozóanyag mennyiség 300 g
37 3 ANYAG ÉS MÓDSZEREK MINI-GLATT RENDSZER A fejlesztés kezdetén az eljárásokat az alsó permetezéses konfigurációban hajtották végre kolbász nélkül. A permetezéshez 0,5 mm belső átmérőjű kétfolyadékos fúvókát használtak. A hordozóanyag fluidizálása és a permetoldat porlasztása a ház vezetékéből származó sűrített levegővel (6 bar) történt. A sűrített levegőt a rendszer nyomáscsökkentőjével állítottuk be. A fluidizáló levegő hőmérsékletét a rendszer fűtésével lehet beállítani. A standard paraméterek a fülön vannak felsorolva. Fül: Standard értékek Mini-Glatt tesztek: Folyamatparaméterek, permetoldat, hordozóanyag Folyamatszabályozási paraméterek Érték (egység) Fluidizációs nyomás 0,5 bar Permetezési nyomás 0,5 bar Előtolás szórási folyadék 0,36 g/perc Termékhőmérséklet 32 C Kifúvási intervallum (szűrő) 10 s Kifújási nyomás (szűrő) 1 bar Kifújási folyadék rhil -11 4 mg/ml foszfátpuffer 10 mM, ph = 7,0 glicin 300 mM permetlé mennyiség 15 g hordozóanyag mennyiség 20 g