Szelén nanorészecskék aerob biogenezise enterobacter cloacae z0206 által
alanyok
absztrakt
Jelen tanulmányban az Enterobacter cloacae Z0206 mérgező nátrium-szelenit redukáló képességét és ennek a folyamatnak a mechanizmusát vizsgáltuk. Megállapították, hogy az E. cloacae Z0206 akár 10 mM szelenitet teljesen elemi szelénné (Se °) redukál és szelén nanorészecskéket (SeNP) képez aerob körülmények között. Az E. cloacae Z0206 sejt szelenit-redukáló effektorának membrán lokalizált enzimnek kell lennie. Az iTRAQ proteomanalízis kimutatta, hogy a szelenit jelentős növekedést váltott ki a fumarát-reduktáz expressziójában. Ezen túlmenően, mind a fumarát hozzáadása a húsleveshez, mind a fumarát-reduktáz (frd) kikapcsolása jelentősen csökkentette a szelenit redukció sebességét, feltárva az E. cloacae Z0206 fumarát reduktáz korábban fel nem ismert szerepét a szelenit redukcióban. Ezzel szemben a festő típusú glutation által közvetített válaszok nem voltak az elsődleges út a szelenit redukcióhoz. Összefoglalva, az E. cloacae Z0206 hatékonyan redukálta a szelént Se ° -ra fumarát-reduktáz felhasználásával, és SeNP-ket képzett; Ezt a képességet fel lehet használni egy bioreaktor kifejlesztésére a Se szennyeződések kezelésére és a SeNP-k bioszintézisére a jövőben.
bevezetés
Kimutatták, hogy a szelenit Se ° -vá történő redukcióját a mikrobiális méregtelenítési stratégia részeként a citoplazmában található tiolok (festői reakciók) közvetítik 29. A szelenit reagál a GSH-val, és szelenodiglutationt (GS-Se-SG) képez, amelyet a NADPH-glutation-reduktáz tovább redukál glutation-szelenoperszulfiddá (GS-Se -). A GS-Se - instabil köztitermék, hidrolízisreakción megy keresztül, így Se ° és redukált GSH képződik. A festői válaszok mellett beszámoltak arról, hogy számos anaerob légzéshez szükséges terminális reduktáz, két nitrit-reduktáz, egy indukálható szulfit-reduktáz és egy fumarát-reduktáz képes csökkenteni a szelenitet a 30, 31, 32 sejtekben. 33 .
Az Enterobacter cloacae SLD1a-1 szelenáttal lélegző fakultatív anaerobe kimutatták, hogy katalizálja a szelenát és a szelenit redukcióját Se ° 12, 34, 35 1, 5 mM-re. Kimutatták, hogy a szelenát redukcióját membránhoz kötött 36, 37 molibdoenzim közvetíti, de a selenit redukciójának mechanizmusa ebben a törzsben nem tisztázott. Ezen túlmenően az E. cloacae bevonásával végzett összes szelenit-redukáló tesztet anaerob környezetben hajtották végre, és az E. cloacae szelitin-redukáló képességét még nem tesztelték aerob körülmények között. Megállapítást nyert, hogy az E. cloacae Z0206 törzs, amelyet a Reishi gomba (Ganoderma lucidum) "húsából" 38 izoláltunk, kiváló szelenitrezisztenciával rendelkezik, és több mint 100 mM szelenitet tolerál. Jelen vizsgálatunkban megvizsgáltuk (i) az E. cloacae Z0206 képességét a szelenit csökkentésére aerob körülmények között, (ii) az előállított SeNP tulajdonságait és elhelyezkedését, és (iii) a szelenit redukció mechanizmusát a Z0206 törzsben.
Eredmények és vita
Az E. cloacae Z0206 növekedési profilja és szelenit-redukáló képessége különböző szelenit-koncentrációknál
Az E. cloacae Z0206 növekedése és szelenit redukciója különböző szelenit koncentrációk jelenlétében. ( A. Nyilvánvaló változások az elfogyasztott húslevesben. ( B. ) Növekedési profil különböző szelenit-koncentrációknál. A baktériumtenyészet 1 ml-es mintáit különféle baktériumnövekedési időintervallumokban gyűjtöttük össze, majd 10 percig 4 ° C-on és 10 000 x g-vel centrifugáltuk. A fehérjét a pelletből kivontuk egy tesztkészlettel a teljes baktériumfehérje-extraháláshoz. A baktériumok szaporodását az összes sejtfehérje mennyiségi meghatározásával mértük. Meghatároztuk a baktériumsejt-kivonatok fehérjekoncentrációját. ( C. ) A baktériumok mennyisége az időpontban 96 óra. ( D. ) A húsleves szelenit-maradék dinamikus változásai. ( E. ) A szelenit redukció kinetikai vizsgálata E. cloacae Z0206 alkalmazásával különböző szelenit koncentrációk mellett. A vonaldiagramok és az oszlopdiagramok átlag ± SD, ** P formában jelennek meg
Az E. cloacae Z0206 által szintetizált SeNP-k jellemzése és lokalizálása. ( A. ) E. cloacae Z0206 és SeNP-k SEM képe. ( B. ) A szén-, nitrogén-, oxigén- és szeléntartalom EDX-elemzése a ( A. ). ( C. ) A szelén, a szén, az oxigén és a nitrogén eloszlásának elemzési térképi elemzése a ( A. ). ( D. ) Az E. cloacae Z0206 és SeNP TEM képei. ( E. ) Az 1. és 2. részecske EDX-elemzése ( D. ). ( F. ) Az E. cloacae Z0206-ból szintetizált nagy tisztaságú SeNP-k nagy felbontású Se 3D XPS-je.
Az E. cloacae Z0206 sejtek különböző sejtfrakcióinak szelenit-redukáló képessége
Az E. cloacae Z0206 különböző frakcióinak szelenit redukáló képessége. A baktérium szelenit redukáló képességét a következő reakcióelegy alkalmazásával becsültük meg: 100 µg fehérje, 10 mM szelenit és 10 mM NADH 200 µl Tris-HCl-ban (pH 7,5). A reakcióelegyet 37 ° C-on inkubáltuk 8 órán át. A reakcióelegy a teljes sejtfrakcióval és szelenit nélkül pozitív vagy negatív kontrollként szolgált.
Az E. cloacae Z0206 fehérjék iTRAQ elemzése a szelenitre adott válaszként
Az azonosított fehérjék közül a szelenit a fumarát-reduktáz gyakoriságának 2,42-szeres növekedését váltotta ki (1. táblázat). Li és mtsai. A 33. ábra azt mutatta, hogy a szelenit redukcióját a Shewanella oneidensis MR-1-ben a fumarát-reduktáz közvetíti, ami azt jelzi, hogy a fumarát-reduktáz szerepet játszhat az E. cloacae Z0206 szelén-redukciós folyamatában. Azonban a leggyakrabban elvárt antioxidáns fehérjék, mint például a glutation-szintetáz, a glutation-reduktáz, a glutation-diszulfid-reduktáz, a tioredoxin, a tioredoxin-reduktáz és a tioredoxin-függő tiol-peroxidáz, nem mutattak szignifikáns változást a szelenitkezelésre adott válaszban (lásd az S2 táblázatot, alátámasztó információk).
A kiválasztott gének mRNS-gyakoriságának elemzése
Az iTRAQ elemzés eredményeinek igazolásához értékelték a fumarát-reduktáz enzim (frd) és a glutation-szintetáz (gsh A), a glutation-reduktáz (gor), a tioredoxin (trx A) és a tioredoxin-reduktáz (trx B) antioxidáns enzimjeit. Amint a 4. ábrán látható, a gsh A, gor, trx A és trx B mRNS expressziója a sejtekben a szelenit stimuláció után nem különbözött a szelenit kezelés előttiétől. A szelenitkezelés azonban időfüggő módon elősegítette az frd mRNS-expresszióját. Ezek az adatok megerősítették, hogy az E. cloacae Z0206 Paum-típusú GSH-mediált reakció helyett fumarátreduktázzal redukálhatja a szelént Se 0-vá.
A szelenit hatása a fumarát-reduktáz és a festői reakciókban részt vevő enzimek transzkripciójára. Az E. cloacae Z0206 egy éjszakán át tartó tenyészetét OD 600 = 1 értékre állítottuk, és friss húslevesbe hígítottuk (1%). Amikor a tenyészet elérte az álló fázist, a tenyészetből 2 ml-es mintát vettünk (Se-mentes kontrollként). Ezután egy 500 µm-t 1 alikvot nátrium-szelenit törzsoldatot (1 M) adunk hozzá, és a tenyészetet további 120 percig inkubáljuk. A mintákat a szelenit hozzáadása után 30, 60 és 120 perccel gyűjtöttük. * P
A BSO hatása a növekedésre és a szelenit redukcióra az E. cloacae Z0206-ban. ( A. ) Az E. cloacae Z0206 növekedése 1,5 mM, 3,0 mM és 5,0 mM BSO jelenlétében. A sejteket ezután 5 mM szelenit jelenlétében 0 mM, 1,5 mM vagy 3,0 mM BSO hozzáadásával inkubáltuk. Különböző időpontokban vettünk mintákat a szelenitmaradványok meghatározására, és sejtmintákat vettünk 24, 48 és 72 órában az intracelluláris GSH koncentrációk mérésére. ( B. ) Szelenit redukció BSO jelenlétében. Az eredményt a kezdeti szelenit-koncentráció százalékára számítottuk. ( C. ) A BSO hatása az intracelluláris GSH koncentrációkra. * P 33 létezett, és a fumarát-reduktáz lehet a szelenit redukció fő útja az E. cloacae Z0206-ban.
Mód
Z0206 baktérium törzs és tenyésztési körülmények
Az E. cloacae Z0206 törzs, amelyet korábban már izoláltunk 38, optimalizált húslevesben volt (szacharóz 25, tripton 5, élesztő kivonat 5, K 2 HPO 4 · 3H 2 O 2, 62, KH 2 PO 4 1, MgSO 4). 0,5 in) tenyésztett g L-1) 32 ° C-on és 250 fordulat/perc sebességgel.
Baktériumok növekedése szelenit stressz alatt
A szelenit hatását az E. cloacae Z0206 szaporodására 0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM és 15 mM nátrium-szelenit jelenlétében határoztuk meg. A nátrium-szelenitet 1 M törzsoldatként állítottuk elő és szűréssel sterilizáltuk. Ezután 500 ml 100 ml húslevest tartalmazó Erlenmeyer-lombikokat növekvő koncentrációjú szelenittel (0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM és 15 mM) egészítettünk ki, és egy éjszakán át tartó baktériumtenyészetet OD 600-ra csökkentettünk. állítsuk be = 0,5 és inokuláljuk (1% oltóanyag-méret) a fent említett táptalajra, amely különböző koncentrációjú szelenitet tartalmaz, majd inkubáljuk 32 ° C-on, 250 fordulat/perc sebességgel 96 órán át.
A szelenit koncentráció meghatározása
A tenyészetet összegyűjtöttük, és 10 000 x g sebességgel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük a maradék szelenit kimutatására a 2,3-diaminonaftalin-fluorometrikus 41-es módszerrel. A szelenit kimutatásával kapcsolatos további információk az 1.2 szakaszban találhatók a "További információk" részben.
SEM és EDX elemzés
A Z0206 tenyészeteit különböző koncentrációjú szelenit (0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM és 15 mM) jelenlétében gyűjtöttük össze. Ezeket a mintákat 4 ° C-on és 12 000 x g-vel centrifugáltuk 15 percig, majd a pelleteket mostuk (0,1 M PBS), fixáltuk, szárítottuk és porlasztó bevonattal láttuk el, majd SEM-ben megfigyeltük. A kiválasztott területek elemösszetételének térképeit az EDX rendszerrel elemeztük.
TEM és EDX elemzés
Különböző szelenit-koncentrációk (0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM és 15 mM) jelenlétében tenyésztett Z0206 tenyészeteket gyűjtöttünk. Ezeket a mintákat 15 percig 4 ° C-on és 12 000 x g-vel centrifugáltuk, majd a pelleteket mostuk (0,1 M PBS), rögzítettük, szárítottuk és beágyazottuk. 100 nm-es ultravékony metszeteket vágtunk és festettünk, majd TEM-ben megfigyeltük. A kiválasztott részecskék elemi összetételét az EDX rendszerrel elemeztük.
Lásd a részecskék valenciájának elemzését
Az E. cloacae Z0206-ot 5 mM szelenit jelenlétében tenyésztettük 72 órán át 32 ° C-on és 250 fordulat/perc sebességgel. A szelénrészecskéket a tenyészetből Dobias és munkatársai által leírt módszer szerint nyertük. Leválasztott protokoll. 42. kis változtatással. Röviden, a tenyészetet dekantáltuk, majd egyszerű szuszpenziót folytattunk 4 ° C-on 8000 x g-vel 10 percig a szuszpendált biomassza elválasztása céljából. Az előző centrifugálási lépésből származó felülúszóban jelen lévő összegyűjtött Se részecskéket centrifugálással 4 ° C-on és 20 000 x g-vel 15 percig koncentráltuk. A pelletet ezután liofilizáltuk és XPS alkalmazásával elemeztük.
Sejtfrakciók szétválasztása és a szelenit-redukáló aktivitás meghatározása
Szelenit nélkül exponenciális fázisig tenyésztett E. cloacae Z0206 tenyészetet összegyűjtöttünk és 10 percig 4 ° C-on és 10 000 x g-vel centrifugáltuk. Ezután a felülúszót összegyűjtöttük és 0,2 um-es szűrő segítségével leszűrtük. Ezután az üledéket kétszer mossuk 10 mM Tris-HCl-rel (pH 7,5), és ugyanabban a pufferben szuszpendáljuk ultrahanggal, majd centrifugáljuk 4 ° C-on, 6000 x g-vel 10 percig a töretlen sejtek elválasztása céljából. Ezután a felülúszót 4 ° C-on, 25 000 x g-vel 40 percig centrifugáltuk a citoplazmatikus (felülúszó) és a membrán (pellet) frakciók elválasztására. A fehérjekoncentrációt BCA assay kit segítségével mértük.
RT-PCR elemzés
Az RNS-t RNeasy Protect Bacteria Mini Kit-rel extraháltuk. A teljes RNS-t reverz transzkripciós reakciónak vetjük alá Quanti Tect reverz transzkripciós készlet alkalmazásával. A kvantitatív PCR-t egy StepOne Plus ™ valós idejű PCR rendszerrel hajtottuk végre, FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) alkalmazásával.
Az intracelluláris GSH koncentrációk meghatározása
A "BSO hatása a szelenit redukcióra az E. cloacae Z0206-ban" kísérletből gyűjtött sejteket a 24, 48 és 72 órás időpontokban 10 000 × g-on, 4 ° C-on 10 percig végzett centrifugálással koncentráltuk. és 50 mM Tris-HCl-ban (pH 7,5) szuszpendáljuk, majd a sejteket ultrahang segítségével megszakítjuk. A megbontott sejteket 20 000 x g sebességgel 15 percig centrifugáltuk, és a felülúszókat összegyűjtöttük a GSH koncentrációjának meghatározásához Total Glutation Assay Kit segítségével.
A Δ frd mutáns felépítése
A & Dgr; az frd mutáns felépítése a máshol leírtak szerint történt 43. Röviden, egy frd génfúziós fragmenst amplifikáltunk és ligáltunk PCR-en keresztül, majd ligáltuk pLP12-gyel, majd transzformáltuk Escherichia coli β2163-ba. A kapott plazmidokat az E. cloacae Z0206-ba E. coli β2163-mal történő konjugációval juttattuk be. Két szelekciós kör után a törölt frd gént hordozó mutánst PCR-rel validáltuk olyan primerek alkalmazásával, amelyek megfeleltek a deléció előtti és utáni szekvenciáknak (lásd az S4-et a Kiegészítő információkban), majd szekvenálták.
statisztika
Az egyirányú varianciaanalízist (ANOVA), majd az LSD többszörös összehasonlító tesztet alkalmaztuk a statisztikai szignifikancia meghatározásához a többszörös összehasonlításokhoz, a Student-féle t-tesztet pedig a páros összehasonlításokhoz. P