Szubsztituált aromás aminok szintézisének és szerkezetének mutagenitási vizsgálata
Szubsztituált aromás aminok és itro szintézis és szerkezeti mutagenitási vizsgálata új stratégiákat állít elő a mutagenitás csökkentésére O 2 R R H 2 Markus Klein
Szubsztituált aromás aminok és itro-vegyületek szintézise és szerkezeti mutagenitásának vizsgálata Új stratégiák a mutagenitás csökkentésére Értekezés a természettudományok doktori fokozatának megszerzéséhez (Dr. rer. Nat.) A Marburgi Philipps Egyetem Kémiai Tanszékéhez Markus Klein, a Gronau Marburg előadója/Lahn 2
A munka egyes részeit már publikáltuk: M. Klein, G. Boche (1999) A szubsztituált nitrofluorének és aminofluorének regiospecifikus szintézise kulcsfontosságú lépésként az egishi kapcsolási reakcióval, Synthesis 7, 1246-125. M. Klein, U. Voigtmann, T. Haack, L. Erdinger, G. Boche (2) A mutagéntől a nem mutagén nitroarénig: A terjedelmes alkilhelyettesítők hatása a 4-nitrobifenil mutagén aktivitására Salmonella thyphimuriumban. I. rész A nitrocsoportba orto és 2'-helyzetben levő szubsztituensek, Mut. Res. 467, 55-68. M. Klein, L. Erdinger, G. Boche (2) A mutagénektől a nem mutagén nitroarénekig: A terjedelmes alkilhelyettesítők hatása a nitroaromatikus vegyületek mutagén aktivitására Salmonella thyphimuriumban. Rész: A nitrocsoporttól távol álló szubsztituensek, Mut. Res. 467, 69-82. Disszertációként elfogadta a Marburgi Philipps Egyetem Kémiai Tanszéke: 26.6.2. Első lektor: Második lektor: Prof. Dr. G. Boche Prof. Dr. T. Carell A szóbeli vizsga napja: 5.7.2
Nagyok az Úr művei; aki felfedezi, élvezi. Zsoltár 111, 2
Tartalom I.2 Szintézisek és kísérletek 27 I.2.1 Berendezések, vegyszerek, módszerek. 27 I.2.2. 4-itrobifenilek és 4-amino-difenilek alkil- és CF3-szubsztituensekkel. 21 I.2.3. 4-itrobifenilek és 4-amino-bifenilek hidroxi-/alkoxicsoporttal. 22 I.2.4. 4-itrobifenilek és 4-amino-difenilek dialkilamino szubsztituensekkel. 233 I.2.5 Egyéb 4-itrobifenilek és 4-amino-difenilek. 238 I.2.6 2-itrofluorén és 2-aminofluorén. 241 I.2.7 Heteroaromás vegyületek. 25 I.2.8 4-itrosztilbene. 257 I.3 Mutagenitási vizsgálatok 26 J Bibliográfia. 261 III
Rövidítések listája Ábra Ad AIB Arom ATP AcCo A dba CYP d DC DCC DCM DME DMF dppe dppf dppp EE EtOH h IF HMPTA HMDS MO BS PAH PAPS PE PPA Py QSAR THF TAV TBABr 3 TPPTS TFP UDP ábra Adamantil-azobisz-izobutirifoszfát aromás acetil-koenzim A dibenzilidén-aceton citokróm P nap vékonyrétegkromatográfiával diciklohexil diklór-dimetoxi-dimetil-formamid 1,2-bisz (difenil-foszfino) -etán 1,1'-bisz (difenil-foszfino) -ferrocén 1,3-bisz (difenil-foszfino) -ferrocén 1,3-bisz (difenil-foszfino-ecetsav methylsacetamethoxyno (difenil-foszfino-etil-acetát) -hexametranolacetametroxyno (diphenylphosphinoic-etil-acetát) (difenil-foszfino-etil-acetát) (difenil-foszfino-etil-acetát) (difenil-foszfino-etil-acetát) (difenil-foszfino-etil-acetát) Policiklusos aromás 3'-foszfoadenozin-5'-foszfoszulfát-petroléter (4-6 C) polifoszforsav-piridin Mennyiségi szerkezet-aktivitási viszony tetrahidrofurán Jellemző munkautasítások Tetrabutil-ammónium-tribromid-trinátrium-3,3 ', 3' '- foszfantriil-benzolszulfonsav-trisz (2-furil) -foszfin
Bevezetés A.3 A munka célja és felépítése A sok mutagén és rákkeltő anyag közül az aromás aminoknak és az itroaromatikus anyagoknak óriási jelentősége van. Ezeknek az anyagosztályoknak számos képviselőjét állítják elő és alkalmazzák nagy léptékben az iparban, de az égési folyamatok során (gázolaj, füstölés stb.) Vagy a hús melegítésekor is kialakulnak, ezért elterjedtek a környezetben. Az ilyen vegyületek magas rákkeltő képessége valószínűleg részben felelős az iparosodott nemzeteknél a rák folyamatos növekedéséért. Hatásmechanizmusukból adódóan genotoxikusak és metabolikusan aktiválódniuk kell (lásd a B. fejezetet), különösen az amino- és itroaromatikus anyagokkal kapcsolatban, magas összefüggés van a karcinogenitás és a mutagenitás között. Ezen anyagok ipari felhasználása potenciálisan nagy kockázatot jelent az emberi egészségre, és ezért a jogszabályok egyre inkább korlátozzák őket. Az aromás aminok által kiváltott hólyagrák egy elismert foglalkozási betegség, amely az elmúlt 2 évben érintett
8 dolgozó meghalt. 14 Az ipart ezért biztonságosabb helyettesítők kifejlesztésére hívják fel. Pontosan itt kezdődik a jelen munka. Milyen módon kell módosítani az aromás aminokat és az itroaromatikumokat annak érdekében, hogy csökkentsék mutagén potenciáljukat és ezáltal rákkeltő tulajdonságukat, vagy akár teljesen ki is oltsák őket? Ismert rákkeltő anyagokból, például 4-itrobifenil 1, 4-amino-difenil 2, 2-itrofluorén 3, 2-amino-fluor-4 és 4-itrosztilbene 5-ből származó modellanyagok felhasználásával megvizsgáljuk, hogy a funkcionális csoport módosulásából hogyan következnek be strukturális változások, de mindenekelőtt különböző szubsztituensek (például alkil-, CF3-, alkoxi- vagy dialkil-amino-csoportok) bevezetésével az alaptestek mutagenitására. 2. ábra: Hogyan befolyásolják a szerkezeti módosítások a mutagenitást? O 2 O 2 O 2 1 3 5 H 2 H 2 2 4 8
Aromás aminok és itro-vegyületek pl. mert bizonyos bázisszekvenciák ott gyakrabban fordulnak elő - erősebb rákkeltő potenciál, mint azok, amelyek kevésbé specifikusan reagálnak. Az arilaminok, például a 2-aminofluorén vagy a 4-amino-difenil esetében a májdaganatok kialakulása összefüggésben lehet a ras proto-onkogénben lévő 61 kodon első bázisában lévő GT transzverziókkal, azaz a proto-onkogénben. 56 Az addukt képződése után is a szerkezet továbbra is fontos szerepet játszik. A 4-amino-bifenil és a 2-aminofluorén reakcióba lépve összehasonlítható adduktokat képeznek az egér májában, de a 2-aminofluorén DA-adduktjai (pl. - (dezoxi-guanozin-8-il) -2-amino-fluor-5) kétszer annyi daganatot indukálnak, mint a megfelelő adduktok. 4-amino-bifenil (például - (dezoxi-guanozin-8-il) -4-amino-bifenil 41). 57 A Salmonella typhimurium TA1538 számos amin és itroaromatikum mutagenitási vizsgálata hasonló hatásokat mutatott ki (lásd a C. fejezetet). A képződött deoxi-guanozin-adduktok mutációinak indukcióját összehasonlítva szignifikáns különbségeket találtunk a hatékonyság szempontjából: -Acetilbenzidin> 1-itropirol
Az Ames mutagenitási tesztet használjuk a mutációspecifitás meghatározására. 7 Ebből arra lehet következtetni, hogy mely bázisokat támadja meg a végső karcinogén, és milyen típusú bázis szubsztitúciós mutációkat indukálnak a mutagének. Az ilyen vizsgálatokat sokkal könnyebb elvégezni, mint az adduktanalízis klasszikus módszereit. A standard TA98 és TA1 teszttörzsekhez és néhány variánsukhoz (TA98R, TA98/1.8DP 6) képest az új speciális törzseket eddig csak viszonylag kevés tanulmányban alkalmazták, és ennek megfelelően az összehasonlítás alig lehetséges. Áttekintést nyújt az új Ames törzsek kifejlesztésének legújabb fejleményeiről Josephy. 71 Ebben a munkában standard TA1 és TA98 teszttörzseket használtunk metabolikus aktivációval és anélkül. Néhány anyagot a TA98R segítségével is megvizsgáltak. C.3 Végrehajtás A vizsgálati eredmények minél magasabb megismételhetőségének biztosítása érdekében Ames kidolgozott egy szabványosított eljárást, amelyet az alábbiakban röviden ismertetünk. A hisztidint igénylő baktérium törzseket (his-) néhány órán át tápoldatban tenyésztjük, bizonyos sejtsűrűségig (
Szerkezet-mutagenitás összefüggések 17. ábra: A funkcionális csoport helyzetének hatása a H 2 H 2 2 65 TA98 + S9: 79 1,5 Rev/nmol mutagenitásra 6) A hidrofóbicitás gyengébben hatolhat be a baktériumok falába. 39
A kémiailag szintetizált 79 és 81. hidroxil-aminok, például a 77. és 39. szerkezet-mutagenitás összefüggések hatásos mutagének. Nyilvánvaló, hogy a következő lépések - vagyis az OH-csoport észterezése és a DA-val való reakció - sokkal kevésbé érzékenyek a szterikus tényezőkre. 21. ábra: Az 1-aftil-amin és a 2-amino-difenil H 2 HOH H 2 P 45 HOH inaktivitásának okai mutagén mutagén, nem mutagén mutagén H 2 HOH H 2 HOH P 45 2 39 8 81 mutagén mutagén, nem mutagén mutagén Egy másik szerkezeti jellemző, amely minőségileg korrelált a mutagén potenciállal és a legjobban szterikus jelenségként értelmezhető, az anyag aromás jellegének foka és az ezzel járó planaritás. Hirayama után a 2-itropirén 82 lényegesen aktívabb a TA98-ban, mint a TA1-ben, és így elsősorban kereteltolásos mutagénként működik. 95 22. ábra: A planaritás hatása a mutagenitásra (TA98) ii 82 83 TA98-S9: 2569 Rev/nmol 37,7 Rev/nmol Az oldalsó kettős kötések 2-itro-4,5-dihidropirollá és tovább 2- itro-4,5,9,1-tetrahidropiren 83 megy a síkosságra és egyidejűleg i Itt csak a gyűrű oxidációja következik be. ii A szerkezetek geometriáját Chem3D-vel optimalizáltuk az AM1 módszerrel. 41
Szerkezet-mutagenitás összefüggések 7. táblázat: A modellanyagok áttekintése Vizsgálati sorozat Áttételes szerkezet R3 1-I 4-itrobifenil 4 4Bp 1 2 R -O 2 4-Aminobifenil 4ABp 2 1 '-H 2 4-itrosobifenil 4OBp 89 1 4' 2 '3' -O 4-hidroxilaminobifenil 4HOHBp 9 -HOH, -dimetil-4-amino-difenil, -DiMe-4ABp 91 -Me 2-tert-butil-4-amino-difenil-bu-4abp 92 -HtBu-acetil-4-amino-difenil - Ac-4ABp 93 -HOAc 3 2-I 4-itrobifenil 4 4Bp 1 2 O 2 -H 4'-metil-4-nitrobifenil 4'Me-4Bp 94 1 '-Me 4'-etil-4-nitrobifenil 4'Et -4Bp 95 R 4 '1 2' 3 '-Et 4'-izopropil-4-nitro-difenil-4'iPr-4Bp 96 -ipr 4'-terc-butil-4-nitrobifenil-4'Bu-4Bp 97 -tbu 4 '-n-butil-4-nitrobifenil-4'nBu-4Bp 98-nbu 3 2-II 3'-metil-4-nitrobifenil-3-Me-4Bp 4 99 O 2 -H/-Me R 3', 5'- Dimetil-4-nitrobifenil 3 ', 5'DiMe-4Bp 1 1' -Me 3 ', 5'-Di-terc-butil-4-nitrobifenil 3', 5'DitBu-4Bp 11 2 1 4 '2' 3 ' R-bu 4 2-III 4'-Adamantil-4-nitro-difenil-O 4'Ad-4Bp 12 2 -Ad 4-itroterfenilén 4 '4Tp 13-Ph 2-fenil-5-nitropiridin 2Ph5P 2 14-H 4'-terc -Butil-2 -fenil-5-nitropiridin 4'tBu-2Ph5P 15 R 4 '5 O 2 R-bu 3 3-itro-5-fenil-piridin 4 5Ph2P 16 O 2 -H 4'-terc-butil-2-nitro-5-fenil-piridin 4'tBu-5Ph2P 17 5 1 'R 4' 2 '3' 2-VI 2-itrofluorén 2F 3 7 2 -H 2 -tbu 7-metil-2-nitrofluorén 7Me-2F 18 -Me 7-terc-butil- 2-nitrofluorén 7tBu-2F 19 -tbu 7-adamantil-2-nitrofluorén 7Ad-2F 11 -Ad RO 2 5
A modellanyagok szintézise 9. táblázat: A CF 3 -szubsztituált 4-itrobifenilekkel való keresztkötések eredményei F Belépési módszer Termék 3 C O 2 Hozam b 1 Suzuki a 4'CF 3-4Bp 126
Hidroxilamino> amino> itro. Az aminofunkció dimetilezése csak kismértékben csökkenti a mutagenitást a szabad aminhoz képest, mivel a metilcsoportok oxidációval könnyen elszakadnak. Az aminocsoport terc-butilezése vagy acetilezése kevesebb mutagén vegyülethez vezet (92, 93), de ez a hatás nem elegendő a mutagenitás teljes elnyomásához. 14-én
A mutagenitási vizsgálatok eredményei és megbeszélése F.2.1.2 Nagyobb alkil-szubsztituensek Munkacsoportunkban részletesen megvizsgáltuk, hogy a mutagenitás ilyen redukciói átkerülhetnek-e orto-alkil-csoportokkal rendelkező más rendszerekbe is, és így egy általános szerkezet-mutagenitás összefüggést. Schmitt rendelkezik az 1-alkil-2-amino-naftalinokkal (1-alkil-2A) 6, 38-311, az 1-alkil-2-amino-fluor-benzolokkal (1-alkil-AF) 4, 312-315 és 3-alkil-4-amino-difenilekkel ( 3Alkyl-4ABp) 2, 316-319 szintetizált és Ames teszteket hajtottunk végre. 26 A (32-322) általános képletű 3,5-dialkil-4-amino-difenil-csoportokkal (3,5DiAlkil-4ABp) vonatkozó vizsgálatok a Glende 151-től származnak (26. táblázat). Összehasonlító elemzés céljából a revertánsok/(1 nmol) mutagén potenciálját ismét az Ön adatai alapján számítottuk ki regresszióanalízissel a C.5. Szakaszban leírt módszer szerint. Csak azokat az adatokat mutatjuk be, amelyeket S9-Mix jelenlétében kaptunk, mivel az aminok többsége inaktív volt S9-Mix nélkül, mint az várható volt. 82. ábra: Orto-alkilezett 2-amino-naftalinok, 2-aminofluorének és 4-amino-bifenilek Et ipr nbu tbu H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 6 38 39 31 311 Et ipr nbu tbu H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 4 312 313 314 315 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 Et ipr nbu tbu 2 316 317 318 319 Me H 2 Et H 2 ipr H 2 Me Et ipr 32 321 322 18
A mutagenitási vizsgálatok eredményei és megbeszélése 27. táblázat: Az orto-alkilezett 4-itrobifenilek mutagenitásának áttekintése F.2.1.3 vegyület revertánsok/(1 nmol) TA98-S9 TA98 + S9 TA1-S9 TA1 + S9 4Bp 1 8.53-1.31- 3Me-4Bp 323 4.64-24.3-3Et-4Bp 324.51-13.71-3iPr-4Bp 325.43-4.12-3tBu-4Bp 326 69). Ilyen itroelrendezések ismertek az orto-alkilezett itro-vegyületek kristályszerkezeteiből. 112
1% Ha az alaptest szerkezete ilyen egyértelműen befolyásolja a DA konformációk arányát, akkor feltételezhető, hogy a molekula alakját megváltoztató szubsztituensek is hasonlóan befolyásolják. Különösen nagy 134-es adduktokkal
A mutagenitási vizsgálatok eredményei és megbeszélése, amikor a replikáció kevesebb mutációhoz vezet, vagy egyáltalán nem mutat mutációt, az olyan vegyületeknek, mint a 4ABp 2 és a 4'tBu-4ABp 116, szignifikánsan kevésbé mutagéneknek kell lenniük, mint a planáris molekuláknak, például a 2AF 4-nek. A szterikailag igényes szubsztituensek (terc-butil, adamantil) szintén károsíthatják a konformációk dinamikus átalakulását, mivel kedvezőtlen szterikus kölcsönhatások révén növelik az aktiválási energiát ehhez a folyamathoz. 141