Tézis. A Rochr Bochumi Egyetem Biológiai Karán biológiai oklevél megszerzéséhez benyújtották
Diplomamunka Biológiai oklevél megszerzéséhez benyújtva a Ruhr Egyetem Biológiai Karán Bochum A szulfadiazin és metabolitjainak extrahálható és nem extrahálható maradványainak elemzése három évvel a disznótrágya liziméterekre történő felvitele és a nem extrahálható maradványok kukorica rizoszféra általi aktivitása útján történő elvégzése után Készítette: Wibke Schulte-Hunsbeck, a Bochumi Földtudományi Kar Fizikai földrajz/Talajtan/Talajökológia témakörében, szeptemberben. 2009 Előadó: Prof. Dr. Bernd Marschner játékvezető: Prof. Dr. Dominik Begerow
Ez a diplomamunka baráti együttműködésben jött létre a Forschungszentrum Jülich GmbH-val, a német kutatóközpontok Helmholtz Szövetségének tagjával. Intézet Agrosphere ICG 4 Forschungszentrum Jülich GmbH 52425 Jülich (16.6 épület) Intézet vezetője: Prof. Dr. Harry Vereecken helyszíni kapcsolattartó: Dr. Joost Groeneweg
Nyilatkozat Ezennel kijelentem, hogy a ma benyújtott szakdolgozatot önállóan írtam, és a megadottakon kívül más forrásokat és segédanyagokat nem használtam, és megjelöltem az idézeteket. Ez a diplomamunka négy példányból áll, amelyek szóban és képben is teljesen megegyeznek. Kijelentem továbbá, hogy a digitális képek csak az eredeti adatokat tartalmazzák, és hogy a tartalom megváltoztatása érdekében képfeldolgozás nem történt. A dolgozat témavezetője: Prof. Dr. Bernd Marschner társbíróként javaslom: Prof. Dr. Dominik Begerow Bochum, a (felirat)
Tartalom Tartalom-jegyzék Ábra-lista Táblázatok-lista Rövidítések és szimbólumok felsorolása 1! Bevezetés. 13! 1.1! Szulfadiazin. 15! 1.2! Irodalmi áttekintés. 16! 1.2.1! Anyagok szállítása a talajban. 16! 1.2.2! Szorpció a talajban. 19! 1.2.3! Nem extrahálható maradékok. 24! 1.2.4! A szállító SDZ felvétele az üzemben. 25! 1.2.5! Az SDZ bomlása a talajban. 26! 1.2.6! Az SDZ lebomlása fotokémiai úton. 27! 1.2.7! SDZ lebomlása emlősökben. 28! 1.3! Célmeghatározás. 30 2! Anyag és módszerek. 31! 2.1! A tesztpadlók leírása. 31! 2.2! Liziméter. 33! 2.2.1! Teszt liziméter. 35! 2.2.2! A teszt liziméterek előzményei és kezdeti állapota. 36! 2.3! A vizsgált anyag jellemzése. 37! 2.4! Mód. 38! 2.4.1! Mintavételi talaj. 38! 2.4.2! A talajminták előkészítése. 39! 2,5! Kísérő paraméterek. 40! 2.5.1! ph érték meghatározása. 40! 2.5.2! Talajnedvesség meghatározása. 40! 2,6! Talajkitermelés. 41 ! 6.!
2.7. Tartalom! Szilárd fázisú extrakció. 43! 2,8! Növénypróba. 45! 2.8.1! Kísérleti elrendezés. 45! 2.8.2! Mintavételi növények. 47! 2,9! Analitikai módszerek. 48! 2.9.1! Oxidálószer. 48! 2.9.2! LSC mérés. 50! 2.9.3! LC-MS/MS. 51! 2,10! Értékelés. 54 3! Eredmények. 56! 3.1! Liziméteres kísérletek. 56! 3.1.1! 0,5 m! -Liziméter tesztek. 56! 3.1.2! 1 m! -Liziméter. 68! 3,2! Növénypróba. 74 4! Vita. 83! 4.1! Liziméter. 83! 4.1.1! Kísérő paraméterek. 83! 4.1.2! Az SDZ kiegyensúlyozása a liziméterekben. 85! 4.1.3! Szekvenciális extrakció és metabolit elemzés. 90! 4.1.4! Az SDZ sorpciója. 94! 4.2! Növénypróba. 97! 4.2.1! Kísérő paraméterek. 97! 4.2.2! A szekvenált SDZ újra mobilizálása rizoszféra aktivitás útján. 98! 4.3! Összegzés. 100 5! Bibliográfia. 101! 6! A. függelék 106 ! 7.!
Tartalom 20. táblázat: A liziméteres teszt és az A2 (Kal) és B2 (Mer) ültetési teszt talajmintáinak szekvenciális extrakciójának SDZ [mmol g -1] egyenértékű koncentrációja (c ekv.). 81! 21. táblázat: SDZ és metabolitjainak koncentrációja [mmol g -1] az aceto + H 2O extrakció talajmintákban a liziméteres kísérletből és az A2 (Kal) és B2 (Mer) ültetési kísérletből. 82! 22. táblázat: A talajminták szekvenciális extrakciójának ekvivalens mennyisége (A ekv.) [Mmol] az A1 (Kal) liziméterrel a talajmintákból 30 cm mélységig a 29., 120., 218., 1022. mintavételi napon. 106! 23. táblázat: A talajmintákból a B1 (Mer) liziméterrel végzett szekvenciális extrakció egyenértékű mennyisége (A ekvivalens) [mmol] a talajmintákból 30 cm mélységig a 29., 120., 218., 1022. mintavételi napon. 107 ! 11.!
Tartalom A rövidítések és szimbólumok listája Rövidítés 4-OH-SDZ 4-hidroxi-szulfadiazin APG-aktivitás/talaj gramm [Bq g -1] Eq ekvivalens mennyiség [mmol] Aceto. Acety-SDZ BBA c eq Acetonitril N-acetil-szulfadiazin irányelvek a növényvédő szerek és a növényvédő szerek egyenértékű koncentrációjának teszteléséhez [mmol g-1] DNS-dezoxiribonukleinsav FZJ Kutatóközpont Jülich GLP Jó laboratóriumi gyakorlat HPLC nagy teljesítményű folyadékkromatográfia ICG-4 Intézet Agrosphere Kal Kaldenkirchen K/B Kick/Brauckmann edények k OC LC-MS/MS LSC Mer MRSA MS NER PKs Szorpciós együttható (n = a szerves szén számára barátságos) folyadékkromatográfia tandem tömegspektrometriával párosítva Folyadék szcintillációs számláló Merzenhausen multirezisztens Staphylococcus aureus törzsek Tömegspektrométer Nem extrahálható maradékok a K s savállandó negatív dekadikus logaritmusa! Sűrűség [g cm - "] SDZ Sulfadiazine SOP Standard Operating Instructions SPE Szilárdfázisú extrakció WHO Egészségügyi Világszervezet Wk max Maximális víztartó képesség [%]! 12!
Bevezetés Az SDZ szállítása a talajban Az SDZ-vel végzett szállítási vizsgálatok azt mutatták, hogy az eltérő eredmények ahhoz vezetnek, hogy az SDZ-t vízzel vagy folyékony trágyával alkalmazzák. Ha SDZ-t folyékony trágyával együtt alkalmaznak, akkor Burkhardt és mtsai. (2005), Kay és mtsai. (2005) és Blackwell és mtsai. (2007) szerint az iszap kedvez az SDZ felszíni lefolyásának. A vizsgálatok kimutatták, hogy a folyékony trágya szilárd tartalma miatt bezárja a finom talaj pórusait, és így az SDZ gyorsabban ürül ki, mint más antibiotikumok (Burkhardt et al., 2005). A talaj típusa itt lényegtelen, gyors felszíni lefolyást figyeltünk meg mind az agyagos talajokban (Blackwell et al., 2007), mind a homokos talajokban (Kay és mtsai, 2005). Ha az SDZ-t folyékony trágyával alkalmazzák, az SDZ többek között a preferenciális áramlás révén jut a talajba, amint azt Burkhardt (2007) tanulmányai kimutatták. 18!
Inkább kezdeményezze a koncentrációt. Minél nagyobb az ion aránya a talajoldatban, annál nagyobb az aránya az ionos bevonatban (Schroeder és Blum, 1992). Az SDZ belső gömb komplexje komplex vegyületek képződésén alapul, és biztosítja a specifikus szorpciót. A molekula vagy a talajoldat ionja ligandumként működik, és kiszorítja a fémion központi atomja körül koordinált ligandumot. A ligandumok közötti kovalens kötések kialakulása miatt ezek a belső gömb alakú komplexek nagyon stabilak (Scheffer és Schachtschabel, 2002). 3. ábra: Kationok szorbciója változó töltésű oxid vagy agyag ásványi felületen (Sigg & Stumm 1994 Aquati Chemistry, Teubner, Stuttgart).! 21.!
A szén-dioxid bevezetését ki kell zárni. A teljes megadott mennyiségnek csak 2% -át 14 CO 2 -nak becsülték. Ez azt mutatja, hogy az SDZ csak nagyon lassan bomlik le a talajban. A jelenlegi vizsgálatok során megállapíthatók a bomlástermékekről, ezáltal 4-OH-SDZ, formil-SDZ és 4- (2-minopirimidinil-1 (2H)) anilint azonosítottak (többek között: Sukul et al., 2008). 1.2.6 Az SDZ fotokémiai lebomlása Az SDZ napfény általi lebomlása (UV sugárzás) pusztán abiotikus lebontási mechanizmus. A fotolitikus lebomlást többek között Sukul és mtsai. (2008), valamint Wollters és Steffens (2005). Ha az SDZ-t hígtrágyával alkalmazzák, akkor hosszabb ideig UV-sugárzásnak van kitéve. Ez az SDZ bomlási útja csak korlátozott mértékben lehetséges talajban. A fotokémiai lebomlás nagymértékben függ a ph értéktől és így a környező komponensektől. Fotokémiai lebontás esetén a közvetett fotolízis dominál (Wolters és Steffens, 2005). A fénykvantumokkal gerjesztett komponensek továbbadhatják ezt a stimulációt az SDZ-re, és így serkentésére ösztönözhetik. A fényérzékeny anyagok a fotodegradáció fokozódásához vezethetnek, például hidrogén-peroxid, huminsavak, fulvosavak és aceton (Sukul et al. 2008)! 27.!
Bevezetés 1.2.7 Az SDZ lebontása emlősökben Az SDZ sertésekben történő biotranszformációja során a beadott 14 C-jelölt SDZ 96% -a ürül. Ez azt jelenti, hogy az állat csak 4% -ot emészt be. Az SDZ sertések biotranszformációját Lamshöft et al. (2007) részletesen megvizsgálta. A radioaktívan jelzett SDZ-t (14 C-SDZ) négy napig etették a sertéseknek, és kiválasztásukat (trágya) az adagolás után 10 napig naponta gyűjtötték. Az összegyűjtött iszapmintákat SDZ és metabolitjai szempontjából elemeztük. Az SDZ 44% -a kiválasztódott a fő metabolitok mellett. A fő metabolitok az acetil-SDZ (21%) és a 4-OH-SDZ (26%) voltak. Más másodlagos metabolitok az N-formil-szulfadiazin (0,1%) és az N-acetil-4-szulfadiazin (1,8%) voltak. A maximális kiválasztás a beadást követő hatodik napon következett be. A trágyán belüli aktivitás eloszlásában 80% a szilárd anyagban és 20% a folyékony fázisban található. A 7. ábra az SDZ lebontásának termékeit mutatja sertésekben. 7. ábra: A 14 C-SDZ lebomlása biotranszformációval (* = a 14 C jel helye) (Lamshöft et al., 2007).! 28.!
Bevezetés Az emlősök lebontása általában két fázisban történik. Az első fázisban olyan enzimek, mint pl A monooxigenáz és a reduktáz szétválasztja a funkcionális csoportokat, vagy a hidrolázhoz hasonlóan a funkcionális csoportok kapcsolódnak (-OH). A második fázisban a keletkező metabolit endogén, vízben oldódó anyaggal van összekapcsolva. Ez növeli a lebontandó anyag vízoldékonyságát, ezért könnyebben ürülhet ki. Az SDZ főleg a vesén keresztül, és csak kis mértékben a májon és a beleken keresztül eliminálódik (Sukul és Spiteller; 2006). Az SDZ teljesen átalakul SDZ formába a metabolitokból származó trágyában (Langhammer, 1989). 3. táblázat: A két fő metabolit, a 4-OH-SDZ és az acetil-SDZ 4-hidroxi-szulfadiazin-N-acetil-szulfadiazin (4-OH-SDZ) (acetil-SDZ) C 10 H 11 N 4 O 3 SC 12 H 14 összegösszetételének jellemzése N 4 O 4S móltömeg 267,27g/mol 310,32g/mol! 29.!
Anyag és módszerek Kaldenkirchen (Kal) Braunerde N: 51 18 25 O: 6 12 12 Merzenhausen (Mer) Parabraunerde N: 50 55 50 O: 6 17 47 8. ábra: A terep helyeinek áttekintése: Merzenhausen (Mer) és Kaldenkirchen (Kal) az NRW-ben! 32!
Anyag és módszerek 9. ábra: Az ICG-4 kültéri liziméter-rendszerének vázlatos rajza süllyesztett, 1 m-es szöggel! Padlómonolit (Pütz, 1993).! 34!
Anyag és módszerek 2.3 A vizsgált anyag jellemzése A kísérlethez használt folyékony trágya az etetési kísérletekből, Lamshöft és mtsai. (2007) 1.2.7. Szakasz. A 99% -os tisztaságú 14 C-SDZ fajlagos aktivitása 8,6 MBq mg -1 volt, és a Bayer AG, Wuppertal gyártotta. Az SDZ-t radioaktívan jelöltük az anilingyűrű 2C-atomján (14 C-SDZ), lásd a 11. ábrát. A jelöletlen SDZ-t a Fluka, Seelze szállította. Radioaktívan jelzett SDZ-t (14 C-SDZ) két sertésbe tápláltunk. Ezzel párhuzamosan a jelöletlen SDZ-t orálisan adták be két másik sertésnek 4 napon belül. A 14 C-SDZ-t kapott állatok 540 mg d-1 (928,8 MBq) teljes dózist kaptak. Ez 30 mg kg -1 d -1 testtömegnek felel meg. Azok az állatok, akik jelöletlen SDZ-t kaptak, összesen 570 mg kg -1 -1 d -1 testtömeg dózist kaptak. A naponta 10 nap alatt összegyűjtött folyékony trágya mintákat 14 C kimutatással elemeztük. 11. ábra: 14 C-jelzett szulfadiazin (14 C-SDZ) (* = a 14 C-jelölés helye) (Lamshöft et al. 2007) 37
Anyag és módszerek 2.4.2 A talajminták előkészítése A következő elemzésekhez a talajt 2 mm-re szitáltuk és PE zsákokba helyeztük. Ezután meghatároztuk a pH-értéket és a talaj nedvességtartalmát a mezőn nedves talajban. A további elemzésekhez a talajt 105 ° C-on állandó tömegig szárítottuk. Ezután kb. 200 g-ot homogenizáltunk egy bolygómalommal (Retsch PM4) (15 perc 250 fordulat/perc sebességgel; Förster et al., 2009). A bolygómalom esetében a centrifugális erő az őrlendő anyagot (talajminta) az őrlőgolyókkal (öt darab) a köszörülőedény falához nyomja, és így súrlódással összetöri. A munka lépéseinek sematikus ábrázolása a 12. ábrán látható. Szántóföldi friss talaj 2 mm-en hét kísérő paraméter (ph-érték, talajnedvesség) -szárítás -homogenizálás -talajkivonás -Oxidiser -LSC elemzés -LC-MS/MS 12. ábra: A talajminta feldolgozásának munkalépéseinek folyamatábra! 39!
Anyag és módszerek 2.5 Kísérő paraméterek 2.5.1 pH-érték meghatározása A ph-értéket a DIN ISO 10390 alapján határozzák meg. A ph értéket a talaj és a kalcium-klorid oldat (0,01 M) szuszpenziójában határozzuk meg egy órás expozíciós idő után, alkalmanként keverés közben egy ph mérővel. A ph-mérőt használat előtt kalibráljuk a ph 4 és ph 7 standard pufferoldatokkal (Blume és mtsai. 2000). Elemzési feltételek Talajrétegenként három ismétlést hajtottunk végre. ph-mérő: Mettler Toledo 1120X Mérés: 10 g száraz, száraz talaj Reagens: 25 ml 0,01 M kalcium-klorid oldat azaz gravimetrikusan, a súly kitérőjén keresztül. A szántóföldről friss nedves talajt lemérik és állandó tömegig szárítják. A talajnedvesség meghatározása a DIN ISO 11465 (1996-12) alapján történik. A talaj nedvességtartalmát a talaj nedves tömegéhez viszonyítva adjuk meg tömegszázalékban. Elemzési körülmények Talajrétegenként három ismétlést hajtottunk végre. Száraz skála: Mettler Toledo HB43-S Halogén tömeg: 0,3 g-2 g talaj! 40!
Anyag és módszerek 6. táblázat: A szekvenciális extrakció sematikus sorrendje Förster és mtsai (2009) szerint. Mérés: 10 g talajban centrifuga csövekben CaCl 2 extrakció Me-OH extrakció Aceto.-H 2 O extrakció - Reagens: 25 ml, 0,01 M CaCl 2 oldat -24 órás rázás a fejen - centrifugálás * - dekantálás - a Mérjük meg a felülúszót -1 ml-rel az LSC-ben (szcintillátor: 10 ml Ultima Gold) -reagensben: 25 ml, metanol -4 órás rázófej-centrifugálás * -dekantálás -mérjük meg a felülúszó mérését -2 ml az LSC-ben (szcintillátor: 10 ml Instagel) -Mikrohullámú emésztés -Reagens: 50 ml 1: 4 (v: v) acetonitril: víz! Vegyünk 20 ml-t a talaj-oldószer szuszpenzióból -Centrifugálás ** -dekantálás - mérjük le a felülúszó mérését -1 ml az LSC-ben (szcintillátor: 10 ml Instagel)! A maradék kivonat - centrifugálás * - dekantálás - a felülúszó lemérése - a felülúszó eldobása Szárítsa meg az alját a centrifugacsőben, hogy később az oxidátorban elégesse *: Allegra 6KR, 30 perc 900 * g-nál **: J2-21 HS, 30 perc 40 000 * g-nál! 42!
Anyag és módszerek 7. táblázat: A CaCl 2 kivonatok SPE alkalmazásával történő tisztításának munkalépései. 1. lépés Térfogatreagens 3 ml metanol 2 3 ml 5:95 metanol: desztillált víz 3 3 ml desztillált víz Víz 4 X * CaCl 2 kivonat 5 20 ml deszt. 6 víz Szárítsa meg a patront 15 perc 7 3 ml metanol, savanyított pH-ra 2 *: A CaCl2-extraktumot egyesítettük, mielőtt az oszlopra vittük volna, 1 ml-t eltávolítottunk és az LSC-ben megmértük. A maradékot lemérjük és centrifugáljuk (30 perc 40 000 * g nyomáson; J2-21HS). A felülúszót felvittük az oszlopra. Az analízis körülményei SPE oszlop: Oasis HLB 6 cc-200 mg (Waters Oasis) Vákuumszivattyú: Vacumbrand SPE rögzítés: SPE-24G Savanyító sav: 200 µl hangyasav! 44.!
Anyag és módszerek 13. ábra: Az ültetési kísérlet kísérleti felépítése (nézet: kukorica növények Kick/Brauckmann edényekben a növénytermesztő pad alatt) Anyag Kick/Brauckmann edények: 16 darab (Ø = 22 cm) Teljes műtrágya: kb. 3 g kék szem (ENTEC), COMPO) Kukoricamag: 12 db PR39K13 (Early Star, Baiano) Mérleg: Mettler Toledo G5002-2 Száraz skála: Mettler Toledo HB43-S Halogén Egyéb: alumíniumfólia, mérőpohár, kézilapát, hajtogatási szabály! 46!
Anyag és módszerek 2.8.2 Mintavételi növények A kísérletet kb. 80 nap elteltével fejeztük be. Feljegyeztük a tesztfelszerelés teljes tömegét, a Kick/Brauckmann edények, a növények föld feletti (szárak és levelek) és föld alatti részek, valamint a talaj súlyát. A rizoszféra csak nagyjából úgy lett kitéve, hogy az ujjakkal összezúzta a talaj morzsáját. A talajt szitálással választották el a megmaradt apró és finom gyökerektől (