Tilman Graulich
Sztereol. Vizsgálat d. Tüdő és légcső b. d. tumor-kach. Egér VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 [email protected] www.doktorverlag.de ISBN: 978-3-8359-6616-1 9 7 8 3 8 3 5 Tilman G édition scientifique VVB LAUFERSWEILER VERLAG Tilman Graulich A tüdő gázcseréjének régiójának és a légcső beidegzésének sztereológiai vizsgálata a tumor cachecticus egérben Kezdeményezés az orvosdoktori fokozat megszerzésére a Justus Liebig Egyetem orvosi osztályán scientifique VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG
A mű minden részében szerzői jogi védelem alatt áll. A könyv teljes tartalmáért a jogi felelősség kizárólag a mű szerzőjét terheli. Bármilyen felhasználás nem engedélyezett a szerző vagy a kiadó írásos beleegyezése nélkül. Ez különösen vonatkozik a sokszorosításra, a fordításokra, a mikrofilmezésre, valamint az elektronikus rendszerek tárolására és feldolgozására. 1. kiadás, 2017 Minden jog fenntartva. A kiadvány egyetlen része sem a Szerző, sem a Kiadó előzetes írásbeli engedélye nélkül nem reprodukálható, nem tárolható lekérési rendszerben, vagy továbbítható semmilyen formában vagy bármilyen módon, elektronikusan, mechanikusan, fénymásolással, rögzítéssel vagy más módon. 2017. évi 1. kiadás, VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen, Printed in Germany édition linguistique VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 e-mail: Redaktion@doktorverlag
A tüdő gázcserélő régiójának és a légcső beidegződésének sztereológiai vizsgálata a tumoros cachecticus egérben INAUGURÁLIS ÉRTEKEZÉS az orvosdoktori fokozat megszerzéséhez a Giessen-i Justus Liebig Egyetem Orvostudományi Karán, Tilman Graulich, Bochum Hannover, 2017
A Giessen-i Justus Liebig Egyetem Orvostudományi Karának Anatómiai és Sejtbiológiai Intézetéből ügyvezető igazgató: Prof. Dr. Evelyne Baumgart-Vogt 1. bíráló: Prof. Dr. Mühlfeld 2. bíráló: Prof. Dr. Weißmann-vitás nap: 2017.09.04 II
Tartalom 1. oldal A rövidítések felsorolása VI 2. A VIII. Ábrák felsorolása 3. A IX. Az alsó légutak anatómiája 1 I.1.1. A felületaktív anyag funkciója és metabolizmusa 4 I.2. A légzőszervek beidegzése 6 I.3. A tüdő alultápláltság és étvágytalanság esetén 7 I.4. Daganat cachexia 9 I.5. Daganat Cachexia és alsó légutak 10 I.6. A munka célja 11 II. Anyag és módszerek 12 II.1. Állatkísérlet 12 II.2. Előkészítés és mintavétel 12 II.2.1. Mintavétel mikroszkópiához 12 II.2.2. Bronchoalveoláris lavage (BAL) 13 II.3. A minták előkészítése 13 II.3.1. Mintavétel mikroszkópiához 13 II.3.1.1. A minták előkészítése fénymikroszkópiához 14 II.3.1.2. Minták előkészítése immunhisztokémiai célokra 15 II.3.1.3. Minták előkészítése elektronmikroszkópiához (EM) 17 II.3.1.3.1. A minták előkészítése a hagyományos transzmissziós elektronmikroszkópiához (TEM) 17 II.3.1.3.2. A minták előkészítése az immunelektron mikroszkópiához (előregyártás) 18 II.3.1.3.3. A minták előkészítése pásztázó elektronmikroszkópiához (SEM) 19 II.3.2. Sztereológia 19 III
II.3.2.1. 21. kötet II.3.2.2. Felületek 23 II.3.2.3. Hosszak 24 II.3.3. Minták előkészítése differenciál centrifugálásra 26 II.4. Statisztika 26 III. Eredmények 27 III.1. Testtömeg és tüdőmennyiség 27 III.2. Mikroszkópia 27 III.2.1. Kvalitatív mikroszkópia 27 III.2.1.1. Fénymikroszkópia 27 III.2.1.2. Immunfluoreszcens mikroszkópia 30 III.2.1.3. Trachealis epithelium 33 pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) III.2.1.4. Kvalitatív transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) 34 III.2.2. Kvantitatív mikroszkópia vagy sztereológia 35 III.2.2.1. Tüdő 35 III.2.2.1.1. A gázcsere régió/parenchima térfogata 35 III. 2.2.1.2. Alveoláris felület 36 III. 2.2.1.3. II típusú alveoláris hámsejtek 36 III. 2.2.1.4. Az LB viszonya az alveoláris epitheliumhoz 37 III. 2.2.2. Trachea 38 III. 2.2.2.1. Beidegződés 38 III. 2.2.2.2. A légcső falának összetétele 39 III.3. Differenciál centrifugálás a felületaktív anyag meghatározásához 41 IV. Megbeszélés 42 IV.1. Az alkalmazott módszer 42 IV.1.1. A kísérlet beállítása, mintavétel, rögzítés 42 IV.1.2. Sztereológia 46 IV.1.2.1. Mintavétel 46 IV
IV.1.2.2. Referencia kötetek 47 IV.1.2.3. Tesztrendszerek a sztereológiában 48 IV.1.2.4. A szövet tájolása 50 IV.1.3. Immunhisztokémia 51 IV.2. Az eredmények megbeszélése 52 IV.2.1. Alveoláris felület 52 IV.2.2. Felületaktív anyagcsere 58 IV.2.3. Vérelemzés 60 IV.2.4. A légcső beidegzése 61 IV.2.5. A légcső morfológiája 63 IV.2.5.1. Porc 63 IV.2.5.2. Hám 63 V. Összegzés 65 VI. Összegzés 67 VII. Referenciák 69 VIII. Anyagáttekintés 82 VIII.1 Pufferek és oldatok 82 IX. CV 85 X. Köszönetnyilvánítás 86 XI. 87. nyilatkozat XII. Saját kiadványok 88 V
1. Rövidítések listája: ábra ABCA3 ábra ATP-kötő kazetta AE1 sejtek Alveoláris epithelsejt típusú I típusú AE2 sejtek Alveolaris epithelialis sejtek 2 típusú AK Antitest típusú Artery BAL Bronchioalveolaris lemosás BGW Csatlakozó szövet BMP Csont Morfogén fehérje bro Bronchius CGRP Calcitonin-Gene Lézeres pásztázó mikroszkóp DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium FBS Fetal Bovine Serum FEV Forced Expiratory Volume FGF Fibroblast Growth Factor FITC Fluorescein Isothiocyanate HRP Torma Peroxidase von Engl. Horsradishperoxidase KG Kontrollcsoport KGF Keratinocyta növekedési faktor LA nagy aggregátumok LB Lamelláris testek a engl. Lamellar Bodies LLC Lewis tüdő karcinóma LM fénymikroszkópia KGF keratinocita növekedési faktor Mito mitokondrium NANC nem adrenerg nem kolinerg sejtmag PBS foszfátpuffer sóoldat PDGF vérlemezkéből származó VI.
PFA PPAR-γ Ref RF SA SD SMC SP SP-A SP-B SP-C SP-D SURS Tab TEM TF TG TGF-β TK TNF-α UA + O UD VEGF ad VIP ZP zz Paraformaldehid Peroxisome Proliferator által aktivált receptor γ referencia Richardson festés Kis aggregátumok félvékony simaizomsejtek a engl. Sima izomsejt felületaktív fehérje felületaktív anyag fehérje A felületaktív anyag fehérje B felületaktív anyag fehérje C felületaktív anyag fehérje D szisztematikus egységes véletlenszerű mintavételi táblázat transzmisszió elektronmikroszkópia tesztmezők Tumorcsoport transzformáló növekedési faktor β Tumorkachexie Tumor Necrosis Factor-α Uranumtharutularis endoreptor
2. Ábrák felsorolása: I. ábra: A tüdő szerkezete az egér példájával 4 II. Ábra: A tüdőminták mintavétele mikroszkópiához 14 III. Ábra: Az állatok testtömege a kísérletek elején (A) és végén (B) 27 IV. Ábra: Összehasonlító fénymikroszkópia A tüdő parenchima ábrázolása alveolusokkal és kapillárisokkal 29 V. ábra: A légcső beidegződésének immunfluoreszcens mikroszkópos ábrázolása 30 VI ábra: A légcső immunfluoreszcens mikroszkópos ábrázolása 3D felület rekonstrukcióval 32 VII. Ábra: A légcső idegrostjainak immunfluoreszcens mikroszkópos ábrázolása VIII ábra A trachealis epithelium pásztázó elektronmikroszkóp képei 34 IX. Ábra: A trachealis fal transzmissziós elektronmikroszkópos képei 35 X ábra: A felületaktív rendszer sztereológiai adatainak áttekintése 21 nap után 38 XI. XII: A sztereológiai mintavételi rendszerek összehasonlítása 47 XIII. Ábra: A mért növekedési faktorok és lehetséges hatásaik diagramja 57 VIII
3. Táblázatok felsorolása: I. táblázat: Felhasznált antitestek (AK) 16 II. Táblázat: Antitestek (AK) az előkészítéshez 19 III. Táblázat: Az állatok száma csoportonként és a vizsgált sztereológiai értékenként 20 IV. A térfogatsűrűség meghatározására szolgáló mérési módszer áttekintése 22f. VI. Táblázat: A meghatározott felületi sűrűségek és felületek áttekintése 24 VII. Táblázat: A felületi sűrűség meghatározására szolgáló mérési módszer áttekintése 24 VIII. Táblázat: A tüdő és a gázcsere régió (parenchima) térfogata 36 IX. Táblázat: Az alveolusok felülete 36 X. táblázat: A II. Típusú alveoláris hámsejtek sztereológiai adatai 37 XI. Táblázat: Sztereológiai adatok a légcső beidegzéséhez 39 XII. Táblázat: A légcső falának sztereológiai adatai 40 XIII. Táblázat: Objektumok az űrben, reprezentációjuk a metszetben és a sztereológiai vizsgálati rendszerek 49 XIV. Táblázat: Egyes növekedési faktorok kvantitatív PCR-je tüdőmintákban 56 XV. és KG 61 IX