Tiszta tenyésztés - mikrobiológiai gyakorlat
-
D1. Kísérlet: Tiszta tenyészetek megszerzése hígító kenet alkalmazásával
Ebben a kísérletben a hígítási kenet különböző technikáit (13 és 3 hurokos kenet módszerrel) kell alkalmazni és tesztelni a tiszta mikrobiális kultúrák előállítása céljából.
3 hurkos kenet módszer:
Itt is az oltási hurkot megolvasztják és lehűtik az oltandó lemez szélén, mielőtt az oltóanyagot felvennék a hígítandó mintából. Az oltási hurkot az oltóanyaggal enyhén az agarra helyezzük, majd szélről szélre, de anélkül, hogy hozzáérnénk, "cikcakk mozdulatokkal" a lemez kb. Az oltási hurkot ismét megolvasztjuk, lehűtjük, a Petri-csészét kb. 90 ° -kal elforgatjuk, majd a kenetet úgy alkalmazzuk, hogy az anyag az első kenet mögé kerüljön, az anyagot felcsúsztatva felkapja, és ez az anyag a lemezen keresztül folytatódik újabb "cikk-cakk mozdulat" kerül terjesztésre. Az oltási hurkot ismét megolvasztjuk, lehűtjük, a Petri-csészét kb. 90 ° -kal elforgatjuk és egy harmadik kenetet alkalmazunk, analóg módon a második kenetre vonatkozó eljárással. Az alábbi vázlat a háromszemű vonal technikájának ismételt bemutatására szolgál:
1 hét
Ebben a kísérletben a Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens és Rhodotorula glutinis két különböző kenet módszerrel, a 13 vonalas és a három hurkú módszerrel, három különböző táptalajon (HPG, KB és YGC agar) frakcionált keneteket hajtunk végre. Erre a célra a már kiöntött és használatra kész agarlemezeket először a Petri-csészék alsó részén felcímkézték.
A tápközeg összetétele a következő volt:
HPG agar
1000 ml aqua deminhez. hozzáadva:
- 5,0 g élesztő kivonat
- 5,0 g húsból származó pepton
- 0,25 g glükóz
- 15 g agar
YGC agar
1000 ml aqua deminhez. hozzáadva:
- 5,0 g élesztő kivonat
- 20,0 g D (+) glükóz
- 0,1 g klóramfenikol
- 14,9 g agar
B király agar (KB)
1000 ml aqua deminhez. hozzáadva:
- 20,0 g proteáz-pepton
- 10,0 g glicerin (tiszta)
- 1,5 g magnézium-szulfát (MgSO4)
- 1,8 g tri-kálium-foszfát-3-hidrát (K3PO4 × H2)
- 15,0 g agar
A felsorolt agarlemezek mindegyikéből egyet oltottunk be 13-vonalas, egyet pedig háromsoros-módszerrel, így 6 agarlemezt kaptunk. Ebből a célból a sejtszuszpenzió a Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens és Rhodotorula glutinis Jól keverjük össze a kémcső keverővel, majd hűtsük le a lágyított oltási hurkot a KB agarlemez szélén, vegyünk fel egy inokulumot a szuszpenzióból, és helyezzük az agarlemezre 13 vonalas módszerrel. A HPG agart és az YGC agart is oltottuk a kevert tenyészet inokulumával, 13 vonalas módszerrel. A vegyes tenyészetet ezután 3-hurkos kenet módszerrel megkenjük, egymás után oltjuk be a beoltási hurkot a KB, YGC és HPG agarral. Az oltott agarlemezeket ezután fejjel lefelé inkubáltuk: a HPG-lemezeket 2 napig 25 ° C-on, az YGC-lemezeket 25 ° C-on körülbelül 5 napig és a KB-lemezeket 25 ° C-on 3 napig.
3 hét
A harmadik héten elvégezték a kenet-sorozat kenetellenőrzését, ismét figyelemmel a telepek homogenitására, izolálására és morfológiai jellemzőire, valamint a szennyeződésre.
A következő lépésben egy tiszta kultúra Pseudomonas fluorescens egy ferde agar tenyészet és egy kriokultúra előkészítve.
A kapott ferde csövet HPG agarral töltöttük meg (az összetételt lásd fent), és a kriomédium összetétele a következő:
Cryomedium
- 0,5 ml tápoldat
- 0,5 ml 85% -os glicerin
- 3 üveggyöngy (kézműves kellékekből)
Tápanyag közeg
1000 ml aqua deminhez. hozzáadva:
- 5,0 g húspepton
- 3,0 g húskivonat
5. hét
Az ötödik héten az összes lemezt makroszkóposan megvizsgáltuk, és ellenőriztük tisztaságát, homogenitását és szennyezettségét. Ezenkívül az összes agarlemez fluoreszcenciáját megvizsgáltuk UV lámpa (366 nm) alatt. Néhány sejtanyagot a kriokultúra kenetéből a HPG agarra szuszpendáltunk, és ennek oltóanyagát egy megtisztított mikroszkóp tárgylemezre helyeztük, és ezt a kenetet száradás után világos mezőben, 400-szoros nagyítással vizsgáltuk (lásd 4. hét). A ferde agar tenyészet kenetéből származó KB agar lemezt és a kriokultúrából származó HPG agar lemezt félretettük, és a D2 kísérlet kataláz tesztjéhez használtuk fel.
2 hét
Az egyes mikroorganizmusok szaporodása másképp alakult: az YGC agar túlnyomórészt az Rhodotorula glutinis, a KB agar túlnyomórészt Pseudomonas fluorescens és a HPG agar többnyire Bacilus subtilis nyurga.
A HPG, YGC és KB agar lemezek kenetszabályozása a 3 hurokos kenet és 13 vonalas módszerrel az alábbi táblázatokban bemutatott eredményeket hozta:
| +: szennyeződés -: nincs szennyeződés Vezetéknév: A szennyező anyag neve | |||
| 13 soros módszer: | + | P. fluorescens | + |
| 3 hurkos kenet: | - | + | - |
A telepmorfológia jellemzésének eredményeit a következő táblázat mutatja be:
| YGC: Rhodotorula glutinis | piros | 1-2 mm | kerek | sima | konvex | sima, fényes | vajas | - |
| KB: Pseudomonas fluorescens | fehér | 1-4 mm | kerek | sima | lakás | durva | gélszerű | - |
| HPG: Bacilus subtilis | fehér | 1-2 mm | kerek | sima | konvex | sima, fényes | iszapos | - |
3 hét
A HPG agaron végzett második hígítási kenet ellenőrzése a következő eredményt adta:
Rhodotorula glutinis: szennyezett (szennyező Rhizobium Spórák), a telepek jó elszigeteltsége
Pseudomonas fluorescens: szennyezett (szennyező Rhizobium Spórák), a kolóniák nincsenek izolálva
Bacillus subtilis: nincs szennyeződés, a telepek jó elszigeteltsége
4. hét
Az agar ferde tenyészet tisztaságának ellenőrzése Pseudomonas fluorescens a következő eredményt adta:
Fluoreszcencia: Jól
Makroszkopikus homogenitás: Jól
Mikroszkópos homogenitás: Jól
5. hét
A kriokultúra és a ferde kultúra kenetellenőrzése Pseudomonas fluorescens a KB-n és a HPG agaron a következő eredményt adta:
KB agar ferde: fluoreszkáló, makroszkóposan homogén, nincs szennyeződés
HPG agar ferde: fluoreszkáló, makroszkóposan homogén, nincs szennyeződés
KB cryo: fluoreszkáló, makroszkóposan homogén, szennyezett RhizobiumHPG krió: fluoreszkáló, makroszkóposan és mikroszkóposan homogén, nincs szennyeződés
Megállapították azt is, hogy a telepek sárga színezete kifejezettebb volt a KB agaron, mint a HPG agaron. A kriokultúrás lemezeken a növekedés is erősebb volt, mint az agar ferde tenyészkeneteken.
Számla:
A glicerinhez (C3H8O3) 10 g-ot adtunk.
A C3H8O3 moláris tömege az alábbiakból származik:
(12u * 3) + (16u * 3) + (1u * 8) = 92u 92 g/mol
A 10 g/1 l tömeg moláris koncentrációt eredményez:
10 g/92 g/mol = 0,1086 mol/liter
A tri-kálium-foszfát-3-hidráthoz (K3PO4 x 3 H2O) 1,8 g/1000 ml tömeget adtunk.
A K3PO4 x 3 H2O moláris tömege a következőkből származik:
(39u * 3) + (31u * 1) + (16u * 4) + (6u * 1) + (16u * 3) = 266u 266 g/mol
Az 1,8 g/l tömeg tehát a következő moláris koncentrációnak felel meg:
1,8 g/266 g/mol = 0,0677 mol/liter
Az MgS04 magnézium-szulfátra 1,5 g/1000 ml tömeget adtunk.
Az MgSO4 moláris tömege a következőkből származik:
(24,3u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) = 120,3u 120,3 g/mol
Az 1,5 g/l tömeg tehát a következő moláris koncentrációnak felel meg:
1,5 g/120,3 g/mol = 0,0125 mol/liter
Ebben a kísérletben a különböző baktériumtenyészetek kataláz aktivitását (Pseudomonas fluorescens és tejsavbaktériumok).
Az oxigén molekuláris formájában, mint O2 molekula, oxidatív hatása miatt mérgező hatással van minden élő sejtrendszerre, és sejtmérgeként is ismert. Ez még inkább vonatkozik az anaerob organizmusokra, mivel nem használják az oxigént a légzési lánc terminális elektron-akceptoraként, és így nem tehetik ártalmatlanná víz (H2O) formájában. Az oxigén aktiválása 3 különböző formát ölthet, amelyek mindegyikét úgynevezett oxidázok katalizálják, és amelyekben a következő köztitermékek képződnek:
O2 + 4 e - -> O 2- + O 2- oxidionok
O2 + 2 e - -> O2 2- peroxidion
O2 + 1 e - -> O2 - szuperoxidion
Ezeknek az oxigénionoknak a molekuláris oxigén esetében még nagyobb mértékben érvényes: Nagyon reaktív reaktánsok, amelyek tartósan károsíthatják a sejtet és annak alkotóelemeit. Ezért van a legtöbb organizmusban olyan enzimrendszer, amely ártalmatlanná teszi az oxigén redukciójából származó köztitermékeket. Az oxidionok protonokkal reakcióba lépve a sejt számára ártalmatlan vizet képeznek, a peroxidionok pedig a H + protonokkal hidrogén-peroxidot (H2O2) hoznak létre, amely szintén nagyon reaktív és káros a sejtre. A szuperoxid-ion a hidrogén-peroxiddal és a hidrogén-protonokkal tovább reagálva molekuláris oxigént, vizet és hidroxilcsoportot képez, ami viszont mérgező a sejtre. Az oxigén aktiválásának későbbi reakcióit az alábbiakban ismét felsoroljuk:
A hidrogén-peroxid ártalmatlanná tétele érdekében a legtöbb aerob organizmus rendelkezik a kataláz enzimmel, amely a H2O2-t vízre és molekuláris oxigénre bontja:
Vannak olyan peroxidázok is, amelyek protonálással képesek méregteleníteni a hidrogén-peroxidot:
A hidroxilgyökök képződésének elkerülése érdekében az aerob és aerotoleráns organizmusok rendelkeznek a szuperoxid-diszmutáz enzimmel, amely az oxigén aktiválásából származó szuperoxid-iont valamivel kevésbé káros hidrogén-peroxiddá és molekuláris oxigénné alakítja:
Az anaerob organizmusokban általában nincs ilyen enzimrendszer.
A kataláz reakciót a mikroorganizmusok jellemzésére használják azzal, hogy képes megfigyelni a molekuláris oxigénből származó gáz evolúcióját olyan organizmusokban, amelyek rendelkeznek ezzel az enzimmel. Ezzel a reakcióval meg lehet különböztetni az aerob és az anerob, és leginkább az aerotoleráns organizmusokat is. [2]
Ebben a kísérletben a kenet félretett agar lemezeit használtuk Pseudomonas fluorescens a D1 kísérletből (a ferde agar tenyészetből származó KB agar és a kriokultúrából származó HPG agar lemez), valamint a H kísérletből származó tejsavbaktériumok kenetjeiből származó agar lemezek (egy M17 agar Streptococcus és egy Rogosa agar Lactobacillus) kataláz tesztnek vetették alá. Erre a célra az első agarlemezeket egyenesen a laboratóriumi asztalra helyezték, a Petri-csésze fedelét levették, és a kis Erlenmeyer-lombikból elérhető 3% -os hidrogén-peroxid-oldatot (H2O2) ráöntötték úgy, hogy az agart egyenletesen ellepje a folyadék. Röviden megvárták, hogy az agar felett folyadék képződik-e, és az eredményt megjegyezték. Az összes agarlemezt ugyanazon eljárással teszteltük. A vizsgált agarlemezeket az autokláv hulladékába dobtuk.
A ferde agar tenyészetből származó KB agarral végzett kataláz teszt és a kriokultúrából származó HPG agar egyaránt pozitív volt, vagyis vizuálisan kimutatható volt a gáz erős fejlődése, amelyet a folyadék erőteljes habzása és hólyagosodása jellemzett. Mindkét agarlemez (M17 agar Streptococcus és a Rogosa agar Lactobacillus) a H kísérletben semmilyen gázfejlődés nem volt kimutatható.
E kísérlet eredményeként megállapítható, hogy Pseudomonas fluorescens Kataláz-pozitív, ezért rendelkezik a kataláz védőenzimjével, míg a tejsavbaktériumok Streptococcus és Lactobacillus Kataláz-negatívak, és nem rendelkeznek kataláz-enzimmel. Így lehet Pseudomonas fluorescens aerob organizmusnak, a tejsavbaktériumok pedig legalább aerotoleránsnak vagy akár anaerob organizmusnak minősülnek.
Azt is meg kell jegyezni, hogy az előállított gázt is össze lehet gyűjteni és további vizsgálatoknak lehet alávetni annak igazolására, hogy ez valóban oxigén (O2).