Vizsgálatok az immunsejtek perifériás vérben való eloszlásáról étrend által kiváltott elhízottak esetén
1 A Martin Luther Egyetem Orvostudományi Kar Anatómiai és Sejtbiológiai Intézetéből Halle-Wittenberg igazgató: Prof. Dr. med. Heike Kielstein Vizsgálatok az immunsejtek eloszlásáról a perifériás vérben egy diéta által kiváltott elhízott patkánymodellben a tumor indukciója után Értekezés az orvostudomány doktorának tudományos fokozatának megszerzéséért (Dr. med.) született Freibergben (Szászország) Recenzens: 1. Prof. Dr. med. Heike Kielstein 2. PD Dr. med. Hans-Jürgen Seyfarth (lipcse) 3. Prof. Dr. med. Thoralf Lange (Weißenfes)
Az 5. ábra tüdőmetasztázisokat mutatott elhízott állatoknál. Az NK sejtek és monociták eredetileg észlelhető numerikus korlátai felelősek lehetnek azért is, hogy az elhízott állatokban a MADB106 sejtek megtelepedése a tüdőben és ezáltal a tüdőmetasztázisok kialakulása elsősorban lehetséges és gyorsabban halad.
7 Tartalom-jegyzék I. Tartalom-jegyzék 1. oldal. Bevezetés Elhízás Zsírszövet Adipokinek hatása az immunsejtekre Elhízással társult daganatos betegségek Cél Anyag és módszerek Tesztelt állatok és tartás Kísérleti felépítés Tumormodell MADB106 sejtek vagy NaCl injektálása A minta anyagának megszerzése és elemzése Vér- és szerveltávolítás Lipidek extrakciója és koncentrációjának meghatározása Immunológiai tesztek PBMC izolálás és eritrocita lízis Schwinzer szerint A PBMC szám meghatározása Neubauer számláló kamrával Specifikus immunsejtek festése fluorokrómhoz kapcsolt antitestek felhasználásával Flow citometriai mérések FACS kiértékeléssel FACS NK sejtek, daganatos sejtek és NK sejt-tumor sejtkontaktusok vagy felületes metasztázisok mennyiségi meghatározása Tüdőszövet A relatív mrna-koncentráció meghatározása normál testsúlyú vagy elhízott F344 patkányok lépszövetében valós idejű PCR statisztikák segítségével 26
8 Tartalom II 3. Eredmények A kísérleti állatok súlyának alakulása Rövid távú kísérlet Hosszú távú kísérlet Triglicerid és koleszterin koncentráció a májban Fluorezens-aktivált sejtválogató (FACS) - mérések rövid távú kísérletben NK sejtek B limfociták T limfociták Citotoxikus (CD8 +) T -Sejtek T-helper sejtek (CD4 +) monociták Fluorezens-aktivált sejtrendező (FACS) - mérések hosszú távú kísérletben NK-sejtek B-limfociták T-limfociták Citotoxikus (CD8 +) T-sejtek T-helper sejtek (CD4 +) monociták mennyiségi meghatározása NK sejtek MADB106 sejtek és NK sejt-tumor sejt kölcsönhatás, valamint felszíni tüdőmetasztázisok Aktiváló és gátló NK sejtreceptorok relatív mrna-koncentrációja és lépszövetben NK-sejt-specifikus citokinek relatív mrna-koncentráció rövid távú kísérletben Relatív mrna- Koncentrációk hosszú távú kísérletekben Megbeszélés összefoglaló irodalomjegyzék 58
9 Tartalomjegyzék III 7. Tézisek 68 Függetlenségi Nyilatkozat Korábbi doktori kísérletek nyilatkozata Táblázatos önéletrajz Köszönetnyilvánítás
10 Rövidítések listája IV Rövidítések listája ANOVA APC BMI CD CFSE CRP DIO FACS FITC IFNγ IL i.v. JAK-STAT KIR MALT MCP-1 MHC MP-NK sejtek mrna Ms IgM/G NaCl NKG2D NK sejtek PBS PBMC PCR PE Varianalízis allofikocianin Testtömeg Index Differenciálódási klaszter Karboxifluoreszcein szukcinimidil észter C-reaktív fehérje Diéta által kiváltott elhízás fluoreszcencia Aktivált sejtválogatás Fluoreszcein-izotiocianát Interferon Gamma Interleukin intravénás Januskinase - Jelátalakítók és transzkripciós aktivátorok Gyilkos sejtek Immunglobulin-szerű receptorok Nyálkahártya társított nyirokszöveti monocita kemotaktikus fehérje-1 fő hisztokompatibilitási komplex Margináló-Pulmonáris-Immunális 2. gyilkos csoport, D tag természetes gyilkos sejtek foszfáttal pufferolt sóoldat perifériás vér mononukleáris sejt polimeráz láncreakció phycoerithrin
11 Rövidítések listája V PE-Cy7 phycoerithrin-Cyanin 7 PPARγ RPMI közepes SEM peroxiszóma proliferátor aktiválja a receptor-Gamma Roswell Park Emlékintézetet Közepes Az átlagos T H1/2 T helper sejtek standard hibája 1/2 T Reg TNFα WHO T szabályozó sejtek daganata -Necrosis Factor Alfa Egészségügyi Világszervezet
32 Tolmácsolási anyagok és módszerek 21. Végül a meghatározott sejttulajdonságokat hisztogram vagy pontdiagram formájában mutatjuk be. Ily módon több mint tízezer sejtet lehet hozzárendelni egy adott populációhoz vagy alpopulációhoz kevesebb, mint egy perc alatt. 5. ábra: Az áramlási citometriás módszer sematikus ábrázolása. Speciális lencsék segítségével a sejteket előre szórt fény (FSC előre szórás) és oldalsó szórt fény (SSC oldalsó szórás) segítségével elemzik. A tükrökkel a fényjeleket úgy igazítottuk, hogy végül detektorok segítségével felvehessék és elektromos feszültségjelekké alakíthassák ki őket. Értékelés FACS Az áramlási citometriai mérések segítségével a B és T sejteket, az NK sejteket és a monocitákat differenciáltan vizsgálták (6., 7. ábra). 6. ábra: Elemzett B, T sejtpopulációk és monociták 7. ábra: Elemzett NK-sejtpopulációk
34 Anyag és módszerek 23 citotoxikus T-sejtek 10. ábra: A citotoxikus T-sejtek vagy T-helper sejtek festésének reprezentatív pontdiagramja; citotoxikus T-sejtek (CD8a PE +, CD4 PE-Cy7 -) a bal felső negyedben; T segítő sejtek (CD8a PE -, CD4 PE-Cy7 +) a jobb alsó negyedben. 11. ábra: A monocita festés reprezentatív pontdiagramja; Monociták (CD4 PE-Cy7 +, CD3 APC -) NK sejtek, nem NK sejtek 12. ábra: NK sejtfestés reprezentatív pontdiagramja; NK sejtek [CD161a világos (CD161a PE +, CD3 APC -)] a bal felső negyedben, nem nk sejtek [CD161a dim (CD161a PE +, CD3 APC -)] a bal alsó negyedben. 13. ábra: CD161a PE kapu, minimum 10,1 az NK sejteknél (CD3 -/CD161a világos) és 10 2,2 a nem nk sejteknél (CD3 -/CD161a dim)
37 Anyag- és módszerstatisztika A statisztikai kiértékelést a GraphPad Prism 5 szoftver (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA) segítségével végeztük. Az adatokat egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) és egy ezt követő Tukey többszörös összehasonlító teszttel értékeltük. Annak érdekében, hogy a diéta és a daganatos sejtek általános hatásait a másik tényezőtől függetlenül meg lehessen határozni, kétirányú ANOVA tesztet hajtottak végre egy ezt követő Bonferroni teszttel. A szignifikancia határ mindkét tesztnél legfeljebb 5% -os hibaszintűségen alapult (P 0,05).
38 Eredmények Eredmények 3.1 A tesztállatok súlyának alakulása Rövid távú teszt A teszt elején a tesztállatok átlagos testtömege a kontrollcsoportban 183,54 g, a DIO csoportban 183,76 g volt. Azok a patkányok, akik normál-kalóriatartalmú étrendet kaptak hat héten keresztül, átlagos súlyukat 58% -kal, 290 ± 2,6 g-ra növelték ez idő alatt. Ezzel szemben a magas kalóriatartalmú DIO-diétát kapó állatok testtömegüket 65,5% -kal, átlagosan 304 ± 3,9 g-ra növelték (3. táblázat). A daganatsejtek vagy a NaCl-hordozó injekciójának időpontjában a DIO-vel táplált állatok szignifikánsan nagyobb testtömeget értek el a kontroll étrendet kapó állatokhoz képest (P = 0,006) (16. ábra). 3. táblázat: A kontroll és DIO patkányok súlyának alakulása az étrend megkezdése utáni rövid távú kísérleti hetekben Súlyfejlődés 183,54 ± 1,5 212,37 ± 1,6 238,13 ± 2,3 255,2 ± 2,34 268, 34 ± 2,4 284,16 ± 2,75 290,24 ± 2,62 kontroll [g] súlyfejlődés DIO [g] 183,76 ± 1,6 227,18 ± 1,79 251,02 ± 2,61 271 .05 ± 2.79 283.24 ± 3.46 297.47 ± 3.8 304.11 ± 3.88 Az átlagértékek és a megfelelő standard hiba (± SEM) megjelennek; n = 8 patkány/csoport
40 Eredmények 29. 4. táblázat: A kontroll és a DIO patkányok súlyának alakulása a hosszú távú kísérlet heteiben az étrend megkezdése után Súlyfejlődés kontroll [g] 195,53 ± 1,81 222,59 ± 2,17 245,93 ± 2,46 259, 45 ± 2,81 271,8 ± 2,88 284,29 ± 3,08 294,75 ± 3,02 Súlyfejlődés DIO [g] 195,53 ± 2,07 227,28 ± 2,47 253,74 ± 3, 33 269,09 ± 3,68 277,51 ± 4,51 294,16 ± 4,14 304,78 ± 4,43 hét a diéta megkezdése után Súlygyarapodás-szabályozás [g] 302,76 ± 3,48 310,51 ± 3, 68 318,04 ± 3,66 329,58 ± 4,09 328,73 ± 4,38 332,49 ± 4,75 332,9 ± 5,47 Súlyfejlődés DIO [g] 312,69 ± 4,98 327, 54 ± 5,90 336,25 ± 6,66 351,76 ± 7,21 352,66 ± 7,34 355,67 ± 7,31 367,84 ± 9,19 Az átlagos ± SEM értékeket mutatjuk be; n = 8 patkány/csoport. A szaggatott vonal a kísérlet kezdete utáni 10. és 11. hét közötti átmenetnél szemlélteti a MADB106 sejtek vagy NaCl injekciójának időpontját.
41 Eredmények 30 Testtömeg grammban * * * * * * * DIO kontroll iv. Injekcióval hetekkel a diéta kezdete után 17. ábra: Súlyfejlődés a kontroll étrend és a DIO diéta 13 hetes etetése után. Az összes vizsgált állat tömegének átlagértékeit (n = 8), ± SEM mutatjuk be. A daganatsejtek vagy a hordozó (NaCl) iv. Injekciója 10 hét után történt. Azokat az időpontokat, amikor a DIO csoport súlya jelentősen eltér a kontroll csoport súlyától, * jelöli. 3.2 Triglicerid és koleszterin koncentráció a májban A máj triglicerid és koleszterin koncentrációja szintén szignifikánsan magasabb volt a DIO patkányokban a kontroll állatokhoz képest (5. táblázat). 5. táblázat: Testtömeg, triglicerid és koleszterin koncentráció a májban kontroll és DIO állatokban rövid és hosszú távú kísérletekben Rövid távú kísérlet Hosszú távú kísérlet MADB106 injekció MADB106 injekció 21 nappal a MADB106 injekció beadása után TG a májban (µmol/g) kontroll 38 ± 8 38 ± 4 DIO 90 ± 15 * 65 ± 9 * koleszterin a májban (µmol/g) kontroll 6,7 ± ± 0,3 DIO 11,0 ± 1,6 * 9,3 ± 0,8 * látható az átlag ± SEM; n = 8 patkány/csoport; szignifikáns értékeket jelöli *, P 0,05; TG = trigliceridek
42 A FACS eredményei - Mérések rövid távú kísérletben NK sejtek Az NK sejtek értékelése 15 percen át tartó rövid tumoros expozíció után szignifikáns különbségeket mutatott a kontroll és a DIO állatok között. A DIO-vel táplált patkányokban szignifikánsan kevesebb NK-sejt volt, mint a kontroll állatokban (a PBMC-k% -ában kifejezve), mint a kontroll állatokban (4,3 ± 0,07, szemben 3,95 ± 0,38 (SEM)% PBMC-kel, ábra. 18.) NK-sejtek (a PBMC-k% -a) KoNaCl KoMADB106 * DIONaCl DIOMADB106 18. ábra: Az NK-sejtszám kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend táplált (Ko), és 15 perccel az MADB106- Tumorsejt-injekció (MADB106) vagy NaCl (n = 8); az átlagértékek ± SEM jelennek meg; szignifikáns különbségeket a kontroll és a DIO csoportok között *, P 0,05; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt.
A B-limfociták eredményei Rövid, 15 perces tumorsejt-stimuláció után a B-limfocita-sejtszám összehasonlítása nem mutatott ki szignifikáns különbséget az egyes csoportok között (19. ábra). B-limfociták (a PBMC-k% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 19. ábra: A B-limfociták kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend táplált (Ko), és 15 perccel a MADB106 tumorsejt után -Injekció (MADB106) vagy NaCl (n = 8); az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt T-limfociták Rövid, 15 perces tumorsejt-stimuláció után a T-limfocita sejtszámának összehasonlítása nem mutatott ki szignifikáns különbséget az egyes csoportok között (20. ábra). T-limfociták (a PBMC-k% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 20. ábra: A T-limfociták mennyiségi értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend táplált (Ko), és 15 perccel a MADB106 tumorsejt után -Injekció (MADB106) vagy NaCl (n = 8); az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt.
44 Eredmények Citotoxikus (CD8 +) T-sejtek 15 perces rövid tumorsejt-stimuláció után az egyes csoportok között nem volt szignifikáns különbség a citotoxikus (CD8 +) T-sejtek számában (21. ábra). 45 Citotoxikus T-sejtek (a T-limfociták% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 21. ábra: A citotoxikus T-sejtek (CD8 +) kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend (Ko ) és 15 perccel az MADB106 tumorsejt-injekció (MADB106) vagy a NaCl (n = 8) után; az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt T segítő sejtek (CD4 +) A T helper sejtek (CD4 + T limfociták) számának összehasonlításakor 15 perces tumorsejt stimuláció után nem volt szignifikáns különbség az egyes csoportok között (22. ábra) ). 75 T helper sejt (a T limfociták% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 22. ábra: A T helper sejtek (CD4 +) kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend (Ko) táplált és 15 perccel az MADB106 tumorsejt-injekció (MADB106) vagy a NaCl (n = 8) után; az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt.
45 Eredmények Monociták Jelentős különbségek voltak a normál testsúlyú és elhízott kontroll állatok monocita sejtszámának összehasonlításában, amelyeket NaCl-vel injektáltunk. Az elhízott kontrollállatokhoz képest a normál testsúlyú kontrollállatoknál a perifériás vérben található PBMC-k alapján szignifikánsan nagyobb volt a monociták száma. A normál testsúlyú és elhízott daganatos állatok összehasonlítása, valamint a DIO és a kontroll csoportok összehasonlítása nem tárt fel szignifikáns különbséget (23. ábra). Monociták (a PBMC-k% -a) KoNaCl * DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 23. ábra: A monociták mennyiségi értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend táplált (Ko), és 15 perccel a MADB106 tumorsejt injekció után ( MADB106) vagy NaCl (n = 8); az átlagértékek ± SEM jelennek meg; szignifikáns különbségek a *, P 0,05 által jelölt csoportok között; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt.
46 A FACS eredményei - mérések hosszú távú kísérletben NK sejtek Ha összehasonlítottuk az NK sejtek százalékos arányát a PBMC-ben három héttel a MADB106 injekció után, nem volt szignifikáns különbség az egyes csoportok között (24. ábra). 4 NK-sejt a PBMC-k KoNaCl KoMADB106 DIONaCl DIOMADB106% 24. ábra: Az NK-sejtszám kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend táplált (Ko), és három héttel az MADB106 tumorsejtek száma után Injekció (MADB106) vagy NaCl (n = 8); az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt B limfociták A B limfocita sejtszámának értékelése még három héttel a MADB106 sejt injektálás után sem mutatott ki lényeges különbségeket az egyes csoportok között (25. ábra). B-limfociták (a PBMC-k% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 25. ábra: A B-limfociták kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend táplált (Ko), és három héttel a MADB106 tumorsejt után -Injekció (MADB106) vagy NaCl (n = 8); az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt.
47 Eredmények T-limfociták A tumorsejtek injektálása után három héttel nem volt szignifikáns különbség az egyes csoportok között a T-limfociták PBMC-k százalékos arányát tekintve (26. ábra). T-limfociták (a PBMC-k% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 26. ábra: A T-limfociták mennyiségi értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízással (DIO) vagy kontroll étrenddel (Ko) tápláltak, és három héttel a MADB106 tumorsejt után -Injekció (MADB106) vagy NaCl (n = 8); az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejtek citotoxikus (CD8 +) T-sejtek A citotoxikus (CD8 +) T-sejtek sejtszámának értékelése 3 hetes daganatnövekedés után nem mutatott ki szignifikáns különbséget az egyes csoportok között (27. ábra). 45 Citotoxikus T-sejtek (a T-limfociták% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 27. ábra: A citotoxikus T-sejtek (CD8 +) kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend (Ko ) és három héttel a MADB106 tumorsejt-injekció (MADB106) vagy a NaCl (n = 8) után; az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt.
48 Eredmények T helper sejtek (CD4 +) A T helper sejtek (CD4 +) sejtszámának összehasonlítása 3 hetes daganatnövekedés után nem mutatott ki lényeges különbségeket az egyes csoportok között (28. ábra). 70 T helper sejt (a T limfociták% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 28. ábra: A T helper sejtek (CD4 +) kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akiket étrend okozta elhízás (DIO) vagy kontroll étrend (Ko) táplált és három héttel a MADB106 tumorsejt-injekció (MADB106) vagy a NaCl (n = 8) után; az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt monociták 3 hetes tumor növekedés után a monociták számának összehasonlítása nem mutatott ki szignifikáns különbséget az egyes csoportok között (29. ábra). Monociták (a PBMC-k% -a) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 29. ábra: A monociták kvantitatív értékelése hím F344 patkányokban, akik étrend okozta elhízást (DIO) vagy kontroll étrendet (Ko) tápláltak, és három héttel a MADB106 tumorsejt injekció után (MADB106) vagy NaCl (n = 8); az átlagértékek ± SEM jelennek meg; PBMC = perifériás vér mononukleáris sejt.