3D hidrogél állványok az ízületi kondrocita tenyésztéshez és a porcképződés protokolljához

Jegyzőkönyv

Valamennyi kísérletet a Stanfordi Egyetem Humán Tárgyi Irányelveinek és a Jóváhagyott Intézményi Felülvizsgálati Testület protokolljának megfelelően végeztük.

1. ízületi kondrociták izolálása

2.bomimetikus hidrogél gyártása

Megjegyzés: Ez a módszer lehetővé teszi a poli (etilén-glikol-diakrilátot) (PEGDA, 5000 g/mol), a kondroitin-szulfát-metakrilát (CS-MA) DPBS-ben tartalmazó hidrogél biomimetikus szintézisét. A fotoiniciátor hozzáadása lehetővé teszi a fotoaktivált térhálósítást. A végső hidrogélkészítmény 7% (m/v) PEGDA-t, 3% (m/v) CS-MA-t és 0,05% (m/t) fotoiniciátort tartalmaz.

  1. Szintetizálja a CS-MA-t metakrilátcsoportokkal végzett CS-polimer funkcionalizálással.
    1. Készítsen pufferolt oldatot 50 mM 2-morfolinoetán-szulfonsavból (MES) és 0,5 M nátrium-kloridból (NaCl) úgy, hogy 1,952 g MES-t és 5,84 g NaCl-ot 200 ml ionmentes vízben (DIH) 20 oldunk. Oldjunk fel 5 g kondroitin-szulfát nátriumsót a pufferolt oldatban.
    2. Adjunk hozzá 0,532 g (4,62 mmol) N-hidroxi-szukcinimidet (NHS) és 1,771 g (9,24 mmol) (3-dimetilaminopropil) -karbodiimid-hidrokloridot (EDC) 1-etil-3- (NHS: EDC mólarány = 1: 2) az oldatot és 5 percig keverjük.
    3. Az oldathoz hozzáadunk 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoetil-metakrilátot (AEMA) (NHS: EDC: AEMA mólarány = 1: 2: 1), és a reakcióelegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk.
    4. Tisztítsuk meg az elegyet dialízissel ioncserélt víz (diH 2O) ellen 4 napon keresztül dialízis csővel (12-14 kDa MWCO).
    5. A tisztított oldatot 0,22 µm-es szűrőn szűrjük át, és az oldatot tartalmazó nyitott csöveket tegyük az exszikkátorba és az O/N vákuumba, és győződjünk meg arról, hogy minden cső fénytől védve van. Az oldott polimert -20 ° C-on tárolja fénytől és nedvességtől elzárva.

3. Sejtek beágyazása

4. RNS extrakció és génexpressziós elemzések

  1. Óvatosan szívja le a táptalajt, és helyezzen steril 1x PBS-t a megterhelt cellára az üres kontroll hidrogélekkel együtt.
  2. Steril spatula segítségével az egyes hidrogéleket vigyük át egy tiszta 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe, és minden csőhöz adjunk 250 μl Tri-reagenst. Az RNS izolálásához kövesse a gyártó utasításait.
  3. Az RNS izolálása és mennyiségi meghatározása után használjon minden egyes mintából 1 ug-ot, és végezzen reverz transzkripciót cDNS-be a High Capacity cDNS reverz transzkripciós készlet használatával.
  4. A TaqMan Arrays Gene Expression kvantitatív PCR használata az érdeklődő gének expressziójának vizsgálatához. Normalizálja a génexpresszió szintjét a GAPDH-ban.
  5. A PCR-körülmények között 2 perc inkubálást kell folytatni 50 ° C-on, hogy a korábbi amplikonokat inaktiváljuk uracil DNS-glikozilázzal, majd 1060-at; perces inkubálás 95 ° C-on a Taq-polimeráz aktiválásához. Ezután végezzen negyven PCR-ciklust, amelyek 15 másodpercig 95 ° C-on és 1 percig 60 ° C-on tartanak.

5. Biokémiai elemzések

6. Mechanikai vizsgálatok

  1. Végezzen korlátlan tömörítési vizsgálatokat egy Instron 5944 tesztrendszerrel, amely 10 N mérőcellával van ellátva.
    1. A kívánt napos in vitro tenyésztés után végezzük el a kompressziós tesztet a sejt-hidrogél állványon és a sejtmentes kontroll hidrogéleken.
    2. Merítse el a mintákat szobahőmérsékleten PBS-fürdőbe, és 1%/sec törzssebességgel tömörítse legfeljebb 15% -os törzsig a porcszövet által ismert terhelési körülmények között ismert 11.12. 13.14.
  2. Hozza létre a feszültséget a feszültséggörbék alapján, és illessze be a görbét egy harmadik rendű polinomegyenlet segítségével. Határozza meg a görbeillesztési egyenlet tangens nyomási modulusát 15% -os feszültségértékek esetén.

Reprezentatív eredmények

PEG és CS csoportokat tartalmazó bioaktív hidrogélek (Ábra 1) ideális platformot jelentenek az emberi ízületi kondrociták 2,3,5,7 tenyésztéséhez és érleléséhez. Különböző életkorú és betegségi állapotú kondrocitákat tenyészthetünk a leírt módszerrel, és elemezhetjük fenotípusuk, génexpressziójuk, valamint a keletkezett porcszövet biokémiai és mechanikai tulajdonságainak meghatározása céljából. Három kondrocita mintát, juvenile-6 hónapos, 34 éves és felnőtt-osteoarthritikus - 74 éves, 3 hét tenyésztés után 3D biomimetikus hidrogélekben gyűjtöttünk. A normál kondrociták, mind a fiatalkorúak, mind a felnőttek génexpressziójának elemzése a COL2A1 és a COL6A1 kondrocita gének expressziójának növekedését mutatta. Ezzel szemben a beteg kondrociták drámai csökkenést mutattak a Col2a1-ben, miközben a COL6A1 expresszió megmaradt. (ábra 2) a kondrogén fenotípus elvesztését mutatja annak ellenére, hogy kedvező biomimetikus közegben termesztették.