A connexin hemichannelek gátlása enyhíti az alkoholmentes steatohepatitist egerekben

alanyok

absztrakt

bevezetés

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) a leggyakoribb krónikus májbetegség, amelynek becsült prevalenciája világszerte 25% 1. A NAFLD a betegségek spektrumát képviseli, a máj steatosisától az alkoholmentes steatohepatitisig (NASH), a májfibrózisig, a májcirrhosisig és végül a hepatocellularis carcinomáig 2. A máj steatosisát a magas zsírtartalmú étrendből származó fokozott zsírsaváramlás, inzulinrezisztencia, gyógyszeres kezelés és genetikai tényezők okozhatják. Mint ilyen, a steatózist triglicerid alapú lipidcseppek felhalmozódása jellemzi a hepatociták citoszoljában 3. A máj steatosis számos kiváltó tényezőként alakulhat ki NASH-vá, például gyulladásos citokinek, adipokinek, reaktív oxigénfajok és endoplazmatikus retikulum stressz hatására 4 .

Eredmények

A TAT-Gap24 és a TAT-Gap19 hatása a rés junction aktivitására és a connexin hemichannel válaszaira

A TAT-Gap24 és a TAT-Gap19 egy aminosav-szekvenciát utánoz a Cx32 és Cx43 intracelluláris hurok régiójában. Megállapítást nyert, hogy a Gap19 kötődik a Cx43 C-terminális régiójához, ezáltal megszakítva az intracelluláris hurok és a C-terminális régió közötti kölcsönhatást, ami viszont gátolja a Cx43 hemichannel 12 nyílását. Úgy gondolják, hogy egy hasonló mechanizmus alapozza meg a TAT-Gap24 Cx32 félcsatornákra gyakorolt hatását. A TAT-Gap24 és a TAT-Gap19 specifitásának felmérésére a Cx hemicsatornák blokkolására, a résátmeneteket nem figyelembe véve, fluoreszcencia-helyreállítást végeztek fotofehérítő elemzés után (FRAP) patkány hepatocita tenyészetekben (n = 4, N = 4) . Különösen a patkány hepatocitákat tettük ki 20 µM TAT-Gap19, 20 µM TAT-Gap24, 50 µM karbenoxolon (CBX), a Cx 17. csatorna ismert gátlója, vagy vivőanyag kontroll 24 és 48 órán át, 24 órán át a lemezezés után. 20 μM-mal együtt alkalmazva a TAT-Gap24 és a TAT-Gap19 nem indukált citotoxicitást az elsődleges patkány hepatocita tenyészeteiben (1. kiegészítő). A CBX csökkentette a fluoreszcencia helyreállítását 24 óra után (p

A TAT-Gap24 és a TAT-Gap19 hatása a máj konnexin fehérje expressziójára. 8 hetes CHFD után ozmotikus pumpát műtéti úton beültettek a hasüregbe, biztosítva a TAT-Gap24 (n = 11) vagy a TAT-Gap19 (n = 12) vagy a fiziológiás sóoldat (n =) 14 1 mg/kg/nap folyamatos felszabadulását 14 ) további 2 hétig, amíg a diéta folytatódik. A Cx26 (21 kDa), Cx32 (27 kDa) és Cx43 (43 kDa) immunblottanalízise elválasztás és blotolás után, majd az eredményeket a teljes fehérjetartalomra normalizáltuk. A patch képek levágásra kerülnek. A teljes hosszúságú blotokat a 4. kiegészítés mutatja. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki.

A TAT-Gap24 és a TAT-Gap19 hatása a biometrikus paraméterekre, a máj szövettanára és a szérum transzaminázokra

A relatív zsírtömeg több mint kétszeresére nőtt, és CHFD-vel táplált egerekben (n = 14) volt az ND-vel táplált egerekhez képest (p 22. Az ND-vel táplált csoportban az összes pontszám 0 volt (n = 10), és volt egy A steatosis pontszámának növekedése (p

A TAT-Gap24 és a TAT-Gap19 hatása a biometrikus paraméterekre és a máj szövettanára a NASH-ban. 8 hetes CHFD után ozmotikus pumpát műtéti úton beültettek a hasüregbe, biztosítva a TAT-Gap24 (n = 11) vagy a TAT-Gap19 (n = 12) vagy a fiziológiás sóoldat (n =) 14 1 mg/kg/nap folyamatos felszabadulását 14 ) további 2 hétig, miközben folytatja a diétát. a ) Az egerek teste, zsírja és mája, valamint a relatív máj- és zsírtömeg. ( ) Steatosis, lobularis gyulladás, ballonképződés és NAS-pontszám az ND csoport (első panel), sóoldati csoport (második panel), TAT-Gap24 (harmadik panel) és TAT-Gap19 (negyedik csoport) májszövetének hematoxilin-eozin festésén alapul Panel) panel). Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be * p-vel

A TAT-Gap24 és a TAT-Gap19 hatása a gyulladásos citokinekre és az oxidatív stresszre a NASH-ban. 8 hetes CHFD után ozmotikus pumpát műtéti úton beültettek a hasüregbe, amely napi 1 mg/kg/nap TAT-Gap24 (n = 11) vagy TAT-Gap19 (n = 12) vagy sóoldat (n =) 14 folyamatos felszabadulását biztosította. ) további 2 hétig, miközben folytatja a diétát. ( a ) Az IFN-γ, IL-6, IL-1β, TNF-α és IL-10 szintje a májszövetben és a szérumban. ( ) SOD, GR, GPx és kataláz aktivitása a májszövetben. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be * p 27 értékkel. Ez vonatkozik a glutation-reduktázra (GR), a glutation-peroxidázra (GPx) és a katalázra, mint antioxidáns enzimekre 28. Valójában a NASH-ban szenvedő egereknek és humán betegeknek csökkent a glutation, SOD és kataláz aktivitása 27, 29. Érdekes, hogy a CHFD-vel táplált egerek májában (n = 14) magasabb GPx-értéket találtunk (p 30,) Hasonló hatások (p 31. A limfocita antigén (LY) 86 esetében nem találtunk különbséget a fehérje szintjén (6 és további 5).

2, 5 u Az M12 kötődik, lehetővé téve a peptid megkötését és intracelluláris megtartását. Úgy gondolják, hogy a Gap24 a Cx32 18-hoz hasonlóan reagál. Mind a TAT-Gap24, mind a TAT-Gap19 kezelt NASH egerek csökkent triglicerid-, koleszterin-, IL-1β-szintet és magasabb SOD-szintet mutattak a májszövetben. Ezenkívül a TAT-Gap19 szintén csökkentette az ALT és a TNF-α szintjét, míg a TAT-Gap24 kezelt egerek IFN-γ szintje alacsonyabb volt. - és IL-6 szintje volt. Hangsúlyozni kell azonban, hogy a rántotta peptid-kontrolljának hiánya miatt a nem specifikus hatások önmagukban nem zárhatók ki teljesen ebből a vizsgálatból. A SOD, a kataláz, a GR és a GPx aktivitás szintje általában csökken a NASH 27, 29 alatt, mert a túltermelt reaktív oxigénfajok közvetlenül lebonthatják az antioxidáns molekulákat és gátolhatják az antioxidáns enzimek aktivitását 44. Mivel a kataláz, a GPx és a SOD enzimatikus aktivitása szoros kapcsolatban áll egymással 44, a kataláz és a GPx aktivitás csökkenése kompenzációs mechanizmust tükrözhet a SOD aktivitás megnövekedett szintje miatt.

Összefoglalva, a Cx hemichannelek gátlása kilátásokat nyithat új terápiás stratégiák kialakítására a NASH kezelésére.

Anyagok és metódusok

Állatok és kezelés

A májsejtek izolálása és tenyésztése

A hím Sprague-Dawley patkányokat (Charles River Laboratories, Belgium) ellenőrzött környezeti körülmények között helyezték el, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. A hepatocitákat kétlépéses kollagenáz perfúziós eljárással izoláltuk, beleértve a soros differenciál centrifugálással történő tisztítást, és a sejtek életképességét tripán kék kizárással értékeltük. Életképes (≥ 85%) hepatociták 0,56 × 105 sejt/cm 2 sűrűségben William's Medium E táptalajban (Invitrogen, USA), 7 ng/ml glukagon, 292 mg/ml L-glutamin, antibiotikumok ( 7, 33 NE), bevont nátrium-benzilpenicillin, 50 ug/ml kanamicin-monoszulfát, 10 ug/ml nátrium-amficillin és 50 ug/ml sztreptomicin-szulfát) és 10% -os szarvasmarha-magzati szérum. 4, 24 és 48 óra elteltével a sejttenyésztő táptalajt eltávolítottuk, és 25 ul-t tartalmazó szérummentes táptalajjal helyettesítettük. g/ml hidrokortizon-nátrium-hemiszukcinát és 0,5. g/ml inzulint adtunk hozzá. A patkányok elhelyezésére, valamint a hepatociták elkülönítésére és tenyésztésére vonatkozó eljárásokat a Vrije Universiteit Brussel állatkísérletekkel foglalkozó etikai bizottsága jóváhagyta (projektszám: 14-210-1), és az összes állatot a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató kritériumai szerint tesztelték. ".

Fluoreszcencia visszanyerése fényfehérítés után

Az FRAP analízishez a sejtek szélesztése után 24 órával a tenyésztett patkány hepatocitákat 50 µM CBX-nek, 20 µM TAT-Gap24-nek, 20 µM TAT-Gap19-nek vagy vivőanyag-kontrollnak tettük ki 30 percig, 24 óráig és 48 órán át. Az FRAP elemzést a korábban leírt módon végeztük el 37. A fehérített sejtben a fluoreszcenciát a kiindulási szinthez viszonyított százalékos regenerálódásként fejeztük ki közvetlenül a fotófehérítés előtt. Hasonló elemzést végeztek a fehérített területről eltávolított sejteken is, hogy ellenőrizzék a fotofehérítést a célterületen kívül. Az egyes kísérletekhez tartozó visszanyerési értékeket a megfelelő vivőanyag-kontroll körülmények között normalizáltuk. Ezenkívül Y 0, plató, tau, félidő és mobil frakció értékeket számoltunk ki nemlineáris görbeillesztés után.

Az extracelluláris adenozin-trifoszfát mérése

Az extracellulárisan felszabaduló ATP-t kereskedelmi forgalomban lévő luciferin/luciferáz vizsgálati készlet (Sigma, USA) segítségével mértük, amint azt korábban leírtuk 37. A TAT-Gap24-et és a TAT-Gap19-et először 37 ° C-on inkubáltuk 0 percig, 6 napig vagy 20 napig egy klasszikus inkubátorban (Galaxy 170S, New Brunswick, Németország). A patkány primer hepatocita tenyészeteket ezután 20 µM TAT-Gap24, 20 µM TAT-Gap19, 50 µM CBX vagy hordozó kontrollnak tettük ki 30 percig. Ezeket a kísérleteket 24 órával az elsődleges hepatociták izolálása után hajtottuk végre.

Szövettani vizsgálat

A májszövet mintákat 10% foszfáttal pufferolt formalinban rögzítettük 24 órán át, és paraffin viaszba ágyazottuk. A minták 5-ben voltak. Hematoxilin-eozinnal vágott és festett M-szakaszok a steatosis, a hepatocelluláris ballonozás, a lobularis gyulladás és a NAS értékelésére a korábban leírtak szerint 22. A steatosis mértékét a következő 4 pontos skála, a 0 fokozatú steatosis alkalmazásával értékelték, amely a hepatociták 66% -át érintette. A lobulagyulladást szintén 4 fokozatú skálán értékelték, nevezetesen 0 fokozatú, gócok nélkül; 1. osztályú, kevesebb mint 2 állomány × 20 mezőnként; 2. fokozatú, 2–4 nyáj × 20 mezőnként; 3. osztályú, több mint 4 állomány × 20 mezőnként. A hepatocita ballonképződést 3 pontos skálán értékelték: 0, nincs; 1. ábra: néhány balloncella; 2, bármely/kiálló balloncellák. A NAS esetében a steatosis, a lobularis gyulladás és a hepatocita ballon jellemzőit 0 és 8 közötti értékekkel kombinálták.

A szérum aminotranszaminázok, a szérum és a máj trigliceridek és a koleszterin elemzése

A máj lipidjeit kloroform/metanol eleggyel extraháltuk. Különösen a májszövetet 1 ml 2: 1 arányú kloroform/metanol oldatban homogenizáltuk, és 22 ° C-on 1 órán át rázattuk Thermomixerben (Eppendorf, Németország). A mintákat 5000 x g sebességgel 10 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolítottuk. Ezután 200 µm. L desztillált vizet adunk hozzá, és a mintákat 8000 x g sebességgel 5 percig centrifugáljuk. Az alsó fázist éjszakán át 37 ° C-on szárítottuk. Az elemzés előtt a lipideket 400 ul butanolban oldjuk (Sigma, USA). Az ALT-t, az AST-t, a triglicerideket és a koleszterint kémiai analizátorral (Labmax 240, Labtest, Brazília) mértük. Az eredményeket IU/l-ben fejeztük ki az AST és az ALT esetében, mg/dl-t a szérum trigliceridek és a koleszterin esetében, valamint µg/mg-ot a máj trigliceridek és a koleszterin esetében.

A gyulladásos máj citokinek elemzése

A májszövetet lízispufferben proteázinhibitorokkal homogenizáltuk (Roche, Németország). A homogenizátumokat 15 percig 14 000 x g-vel centrifugáltuk 4 ° C-on, és a felülúszókban lévő fehérje-koncentrációt Bradford 62. módszerrel határoztuk meg, kereskedelmi készletet (Bio-Rad, USA) felhasználva, szarvasmarha szérum albuminnal standardként. ELISA kiteket használtunk az IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ és TNF-α (BD Biosciences, USA) szintjének mérésére a májban 63.

A máj antioxidáns enzimjeinek elemzése

A teljes transzkriptum elemzése

Immunblot elemzés

A májszövet immunblot-analízisét a korábban leírtak szerint végeztük 63. A nitrocellulóz/PVDF membránokat egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk Cx26-ra irányított primer antitesttel (1/1000 hígítás), Cx32 (1/1000 hígítás), Cx43 (1/1000 hígítás), CD36 (1/250 hígítás), NADPH-oxidázzal (1/250 hígítás) és LY86 (1/500 hígítás) (Sigma, Belgium), majd inkubálás 1 órán át szobahőmérsékleten megfelelő másodlagos antitesttel (1/1000 hígítás Cx26, Cx32 és Cx43 esetén; 1/500 hígítás CD36 esetén, NADPH-oxidáz és LY86) (Dako, Dánia). A denzitometriás elemzést Image Lab 5.0 szoftverrel (Bio-Rad, USA) végeztük. Félkvantifikációs célokra a szignálokat az összes fehérjével szemben normalizáltuk, foltmentes gélekkel mértük, és relatív változásokként fejeztük ki az ND-vel etetett állatokhoz képest.

Statisztikai analízis

Az egyes analízisek biológiai (n) és technikai (N) ismétléseinek száma változó volt, és az eredmények megbeszélésében meghatároztuk. Valamennyi adatot átlag ± átlagos átlaghiba (SEM) formájában fejeztük ki. Az eredményeket statisztikailag dolgoztuk fel egyirányú varianciaanalízissel, post hoc Bonferroni korrekcióval. Az összes adatot GraphPad Prism6 szoftverrel dolgoztuk fel, a 0,05 alatti valószínűség (p) értékeket tekintettük szignifikánsnak.

hálaadás

A szerzők köszönetet szeretnének mondani Dinja De Win, Tineke Vanhalewyn, Paul Claes és Steven Branson elkötelezett technikai munkájáért. Ezt a munkát anyagilag támogatták a Brazíliai São Paulo Egyetem, a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP SPEC 2013/50420-6 és 2016/16182-9), az Európai Kutatási Tanács ( ERC Starting Grant 335476), a Flandriumi Tudományos Kutatási Alap (az FWO támogatásai: G009514N és G010214N) és a Vrije Universiteit Brussel-Belgium Egyetemi Kórház („Willy Gepts Fonds” UZ-VUB).

Kiegészítő elektronikus anyagok

További információ

Megjegyzések

Megjegyzés benyújtásával elfogadja a felhasználási feltételeket és a közösségi irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.