A garat kémiai amputációja és regenerálása a Planarian Schmidtea mediterranea-ban

Összegzés

A Planarian Schmidtea Mediterranea kiváló modell az őssejtek és a szövetek regenerációjának tanulmányozásához. Ez a publikáció egy szerv, a torok szelektív eltávolításának módját ismerteti, az állatokat nátrium-azid kémiai anyagnak kitéve. Ez a protokoll a torok regenerációjának ellenőrzésére szolgáló módszereket is leírja.

Absztrakt

A planáriumok olyan laposférgek, amelyek rendkívül hatékonyan képesek regenerálódni. Ezt a képességet számos olyan őssejtnek köszönhetik, amelyek gyorsan reagálhatnak bármilyen típusú sérülésre. Ezeknek az állatoknak a gyakori sérülési modelljei eltávolítják a nagy mennyiségű szövetet, amely több szervet is károsít. Ennek a széles szövetkárosodásnak a leküzdése érdekében itt leírunk egy módszert egyetlen szerv, a torok eltávolítására a Planarian Schmidtea Mediterranea-ban. Ezt úgy érjük el, hogy az állatokat citokróm-oxidáz-gátló nátrium-azidot tartalmazó oldatba áztatjuk. A nátrium-azid rövid expozíciója az állat torkának extrudálását idézi elő, amit "kémiai amputációnak" nevezünk. A kémiai amputáció eltávolítja az egész garatot és egy kis sebet hoz létre, ahol a garat a belekben fekszik. Kiterjedt öblítés után az összes amputált állat körülbelül egy hét alatt regenerálta a teljesen működő torkot. A test többi részén található őssejtek hajtják az új torok regenerálódását. Itt részletes protokollt adunk a kémiai amputáció, valamint a sikeres amputáció és regeneráció értékelésére szolgáló szövettani és viselkedési módszerek leírására.

Bevezetés

A regeneráció az egész állatvilágban előforduló jelenség, amelynek regenerációs képességei a teljes test regenerálódásától bizonyos gerincteleneknél a korlátozottabb képességekig terjednek a gerinceseknél 1. A funkcionális szövetek pótlása bonyolult folyamat, és gyakran több sejttípus egyidejű helyreállításával jár. Például a szalamandra végtagoknak, az oszteoblasztoknak, a kondrocitáknak, az idegsejteknek, az izmoknak és a hámsejteknek 2-et kell pótolniuk. Ezenkívül ezeket az újonnan létrehozott sejttípusokat megfelelően kell szervezni, hogy megkönnyítsék a végtag új funkcióját. E bonyolult folyamatok megértéséhez olyan technikákra van szükség, amelyek a specifikus sejttípusok regenerálódására és szervekbe történő integrálására összpontosítanak.

A regeneratív válaszok vizsgálatának egyszerűsítésére szolgáló egyik stratégia a specifikus sejttípusok vagy nagyobb szövetgyűjtemények célzott ablációja. Például a nitroreduktáz expressziója bizonyos sejttípusokban a zebrafish-ban a metronidazol 3, 4 alkalmazása után pusztuláshoz vezet. A pro-apoptotikus géneket expresszáló Drosophila lárvákban szövetspecifikus promóterek alatt, az 5, 6 képzelőlemez bizonyos régióit célozva. Mindkét stratégia gyors, de kontrollált károsodást okoz, és a regenerációért felelős molekuláris és sejtes mechanizmusok boncolására alkalmazták őket.

Ebben a kéziratban leírunk egy módszert egy garat nevű teljes szerv szelektív ablációjára a Planarian Schmidtea mediterrán térségben. A planáriusok a regeneráció klasszikus modellje, termékeny regenerációs képességükről ismertek, ahol az egész 7, 8 állatok legkisebb töredékei is visszanőnek. Nagy, heterogén őssejtpopulációjuk van, amely pluripotens sejtekből és a származási ág korlátozott őssejtjeiből áll, 9, 10, 11. Ezek a sejtek szaporodva és differenciálódva pótolják az esetleges hiányzó szöveteket, beleértve a torok-, idegrendszeri, emésztőrendszeri és kiválasztó rendszereket, valamint az izom- és hámsejteket 9, 10, 12. Tudjuk, hogy ezek az őssejtek megindítják a regenerációt, nem értjük teljesen azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek ezeket a különböző sejttípusokat helyettesítik. Meghatározott sérült módszerek, amelyek pontos őssejt-reakciókat képesek kiváltani, segítenek körülhatárolni ezt a komplex folyamatot.

A garat egy nagy, hengeres cső, amely az etetéshez szükséges, és tartalmaz idegsejteket, izom-, hám- és szekréciós sejteket 13, 29. Általában az állat hasán lévő zsebbe rejtve az állat testén átnyúlik, és érzékeli az étel jelenlétét. A garat szelektív amputálásához planárisokat áztatunk egy nátrium-azid nevű vegyi anyagba, amely a C. elegans 14, 15, 16 általánosan használt érzéstelenítő. Planáriumokban való használatáról először Adler et al., 2014-12. Perceken belül a nátrium-azid plazmidok kiteszik a garatukat, és a torok enyhe felkavarásával elválasztják az állatot. Ezt a teljes és szelektív torokvesztést nevezzük "kémiai amputációnak". Az amputáció után egy héttel egy teljesen működőképes torok helyreáll 12-én Mivel a garat az etetéshez szükséges, a funkcionális regeneráció az etetési viselkedés figyelemmel kísérésével mérhető. A következőkben leírjuk a kémiai amputáció, a torok regenerációjának értékelésére és az etetési viselkedés helyreállítására vonatkozó protokollt.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

3. A garat eltávolításának értékelése az amputáció után

Vizsgálja meg az állatokat mikroszkóp alatt (10-20-szoros nagyítással), hogy kiderüljön-e sötét folt a tork eltávolítása után, a 2A. Ábra szerintLátható.
Alternatív megoldásként rögzítse és fehérítse az állatokat Pearson és mtsai. leírt 20. Áztassa az állatokat egy éjszakán át 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolban (DAPI) vagy szövetkultúrában konjugált sztreptavidinben (1 mg/ml, 1: 500 arányban hígítva, 1x foszfáttal pufferolt sóoldatban 0,3% Triton-X). Állatok diákon 80% glicerin/20% 1x foszfátpufferolt sóoldatban és kép fluoreszcens sztereomikroszkóp alatt (2. ábra b) mount.
Jegyzet: A kéziratban szereplő összes képet fluoreszkáló sztereo mikroszkóppal készítettük, 1,0x céltáblával.

4. A garat regenerációjának értékelése az etetési viselkedés mérésével

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A nátrium-azidnak való kitettség megzavarja a planárisok normális mozgékonyságát, ami az állatok nyújtását és mocorgását okozza. Ezek a mozdulatok arra kényszerítik a torkot, hogy az állat hasi oldaláról előjöjjön, és körülbelül 6 percig nátrium-azid oldatban látható a torok fehér hegye (1. b ábra-bal). Néhány perccel később az állatok aktívan összehúzódnak, és a torkot teljesen kitágítják, kiszorítva a testből. (1. b ábra-Központ). Az azid, az állatok és a torok expozíciója után körülbelül 11 perccel lazítson. Ebben a szakaszban a torok tipikus harang alakja jól látható (1. b ábra-jobb oldali ablaktábla). Az egyszerű amputáláshoz fontos megvárni a garat ellazulását.

Mivel a garat egy nagy, pigmentálatlan szövettömeg, eltávolítja a sötét folt megjelenését az amputált állat hátsó oldalán (2A. Ábra). Ez a sötét régió vizuálisan jelzi az élő állatokkal végzett sikeres amputációt. A folt azonnal látható az amputálás után, és másnap hangsúlyosabbá válik. A garat regenerálódásával ez a régió enyhül. A garat regenerációjának szorosabb figyelemmel kísérése érdekében az állatokat DAPI-val vagy streptavidinnel konjugált szövetkultúrákkal is lehet festeni egy éjszakán át (2. ábra b). A torok regenerációjának mennyiségi értékeléséhez annak területe ImageJ szoftverrel mérhető.

1. ábra . A garat köptetése és amputációja. (A) A planáris anatómia sematikus ábrázolása. (B) Az élő állatképeken a garat köpetje látható 100 mM nátrium-azidban való áztatás után. Piros nyilak jelzik a torkot. Méretezési oszlopok = 750 µm. (C) Az élő állatok képe (balra) és a csipesszel végzett amputálás kapcsolási rajza (jobbra). A panelek két különböző lehetőséget mutatnak a torok megragadásához. Az állat hasa felfelé néz. Méretezési sávok = 500 µm. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

2. ábra . A torok amputációjának és regenerációjának értékelése. (A) reprezentatív képek az élő állatokról bizonyos időpontokban az amputáció előtt és után. A középső terület sötét foltot mutat a garat régiójában amputálás után, amelyet szaggatott fehér mező jelöl. Hátoldal felfelé. Méretezési sávok = 500 µm. (B) Az Alexa488-sztreptavidinnel festett állatok reprezentatív képei az amputáció előtt és után bizonyos időpontokban. A középső panel a torok hiányát mutatja az amputáció után. A garat régiója fehér mezővel kiemelve. Felfelé néz. Méretarány = 500 µm. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

3. ábra. A torok regenerációjának értékelése. (A) Képek és vázlata az etetési vizsgálatnak, amelynek során 25 µl májat helyezünk egy 60 mm-es Petri-csésze közepére. A kapcsolási rajz (felső, bal) és a kép (középen) az ép garatú állatok etetési viselkedését mutatja. Jobbra az evő állat képe. Az állatok etetési viselkedésének kapcsolási rajza (bal alsó sarokban) és képe (középen) 1 nappal az amputáció után. Jobbra lent, állat, amely nem evett. Méretarány = 750 µm. (B) Az etetési vizsgálat eredményei. Az állatok aránya, akik az amputációt követően bizonyos időpontokban ételt fogyasztottak (vörös színnel számszerűsítve). Minden időpontban n = 10 állat, három ismétlésben megismételve. Error Bar = SD Kattintson ide az ábra nagyobb verziójának megtekintéséhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Ez a protokoll leírja a torok nátrium-aziddal történő szelektív ablációs módszerét. A planárisoknál végzett további célzott ablációs vizsgálatok módosított műtétet alkalmaztak a fotoreceptorok eltávolítására 21, vagy a farmakológiai kezelést a dopaminerg neuronok 22 eltávolítására. A kémiai amputáció nagy előnye a meglévő módszerekkel szemben, hogy nem igényel műtétet. A torok merev szerkezete a Planarian test többi részéhez képest megkönnyíti annak teljes eltávolítását az állattól, amely sokkal puhább test. A garat elválasztja az állatot egy kis csomópontnál (nyelőcső) 30, amely összeköti a garatot és a beleket, így több reprodukálható seb keletkezik, mint amit egy nagyobb sebészeti eszköz kivált. Fizikai tulajdonságai és az állat többi részével való kicsi anatómiai kapcsolat miatt a torok eltávolítása homogénebb sebeket okoz, mint más műtéti amputációk.

A nátrium-azidnak való kitettség időtartama szintén kritikus a technika sikeréhez. Noha a nátrium-azid rövid expozíciója nem befolyásolja hátrányosan a planaristákat, a hosszú idő mérgező és végül megöli az állatokat. A nátrium-azidról ismert, hogy gátolja az energiától függő folyamatokat a 23, 24 citokróm-oxidáz gátlásával. Ezenkívül elnyomja a transzkripciót és a transzlációt, valószínűleg e reakciók kulcsfontosságú komponenseinek felhalmozódása révén a stresszgranulátumokban 25. Planáriusokban a nátrium-azid expozíció 24 órán át elnyomja a mitózist, ezt követően a sejtek folytatják a szaporodást 12. Változások, mint pl B. Az azid expozíció időtartamának korlátozása, a nátrium-azid alapos öblítéssel történő eltávolítása és a mitotikus túlfeszültség-védelem kiegyensúlyozása a kísérleti tervezés során segíthet ezen korlátok túllépésében.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

A szerzők nem árultak el semmit.

Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretnénk köszönetet mondani Alejandro Sánchez Alvaradónak, aki segített e technika kezdeti optimalizálásában és fejlesztésében. A Carolyn Adler laboratóriumot a Cornell Egyetem magpénzéből támogatják.