A hízósejt hatása a bőrsebek gyógyítására Pseudomonas aeruginosa fertőzött bőrsebek
Az Orvostudományi Kar Dermatológiai, Venereológiai és Allergológiai Klinikájáról Charité Universitätsmedizin Berlin ÉRTEKEZÉS A hízósejt hatása a Pseudomonas aeruginosa fertőzött bőrsebek bőrsebének gyógyulására az orvosi fokozat megszerzéséhez. Doctor Medicinae (Dr. med.) Az orvos kar számára bemutatta Charité Universitätsmedizin Berlin Tröltzsch, Karl-Marx-Stadt/most Chemnitz, doktori fokozat: 2015.09.04-1 -
Szüleimnek dedikálva Lektor: 1. 2. 3. A doktori cím. - 2 -
Tartalomjegyzék összefoglalása. Absztrakt. Célmeghatározás. 1. Bemutatkozás. 1 1.1. A hízósejt-biológia alapjai. 1 1.1.1. Bevezetés. 1 1.1.2. Hízósejtek jellemzői. 2 1.1.3. Eloszlási mintázat és heterogenitás. 3 1.1.4. Eredet és fejlődés. 5 1.1.5. A hízósejt fiziológiája és funkciói. 7 1.1.6. A hízósejt immunológiai kompetenciái. 11 1.2. A hízósejt szerepe a baktériumokkal szembeni természetes immunitásban. 12 1.2.1. Tábornok. 12 1.2.2. A Pseudomonas aeruginosa baktérium. 14 1.2.3. Antimikrobiális peptidek és MZ proteázok, valamint szerepük az MZ által közvetített immunvédelemben. 15 1.3. Bőrsebgyógyulás. 16 1.3.1. Áttekintés. 16 1.3.2. A sebgyógyulás fázisai és mechanizmusai. 17 1.3.3. Sebgyógyulás és hízósejtek - a kutatás állapota. 20 2. Anyag és módszerek. 22 2.1. Állatok. 22 2.1.1. A Kit W/Kit W-v - egér modell. 22 2.1.2. Feloldás. 23 2.2. Sebgyógyítási kísérlet vad típusú és MZ-hiányos egerekkel. 23 2.2.1. Érzéstelenítés. 23 2.2.2. Sebzés, fertőzés és kontroll. 23 iii
2.2.3. Sebmérés. 24 2.2.4. Szövettan. 25 2.3. Bakteriális terhelés a seben. 26 2.4. Sejtek. 27 2.4.1. A csontvelőből származó tenyésztett MZ (BMCMC) megszerzése és tenyésztése. 27 2.4.2. Peritoneális árbocsejtek (PMC) megszerzése. 28 2.4.3. Mágneses sejtek szétválasztása (MACS). 28 2.4.4. A PCMC termesztése. 28 2.4.5. FACS elemzés. 29 2.5. A Pseudomonas aeruginosa tenyésztése. 30 2.6. β - hexosaminidáz vizsgálat. 30 2.7. A baktériumok túlélési arányának meghatározása. 31 2.8. Citospin. 32 2.9. Kvantitatív valós idejű PCR (q-rt-pcr). 32 2.9.1. Alapozó. 32 2.9.2. A PCMC-k stimulálása. 34 2.9.3. RNS izolálás. 34 2.9.4. Az RNS tisztaságának és koncentrációjának meghatározása. 35 2.9.5. Írja át CDN-ben. 35 2.9.6. PCR eljárás LightCyclerrel. 36 2.10. Statisztikai analízis. 37 3. Eredmények. 39 3.1. A Pseudomonas aeruginosa baktériummal való fertőzés után a MZ-hiányos Kit W/Kit W-v egerekben a sebgyógyulás menete késik. 39 3.2. A Pseudomonas aeruginosa fertőzött sebek normális sebgyógyulása hízósejtfüggő. 43 3.3. Az MZ-hiányos Kit W/Kit W-v - egerek BMCMC-kkel történő sikeres rekonstrukciójának szövettani megerősítése. 46 3.4. A PA-fertőzött sebbel rendelkező állatok nem mutatnak szisztémás fertőzés jeleit. 49 iv
3.5. Az MZ csökkenti a Pseudomonas aeruginosa fertőzött sebek baktériumterhelését. 51 3.6. A Pseudomonas aeruginosa baktérium és komponensei nem vezetnek a tenyésztett, peritoneális hízósejtek (PCMC) degranulációjához. 53 3.7. Az MZ csökkenti a Pseudomonas aeruginosa baktérium túlélési arányát a kultúrában. 55 3.8. Az MZ által szekretált antimikrobiális peptidek és proteázok expressziójának kimutatása LPS-sel és PA-val történő stimulálás után. 57 3.9. A Pseudomonas aeruginosa és az LPS 4 és 24 órás stimuláció után kis mértékben megváltoztatja az MZ-specifikus proteázok és antimikrobiális peptidek expresszióját. 59 3.10. Tenyésztett peritoneális hízósejtek a bőr hízósejtjeinek modelljeként. 61 4. Megbeszélés. 64 5. Irodalomjegyzék. 77 6. Nyilatkozat. 99 7. Önéletrajz. 100 8. Köszönetnyilvánítás. Kr. E. 101
Célkitűzés in vivo: 1. A vad típusú Kit +/+ - és MZ-hiányos Kit W/Kit Wv egerek megváltozott sebgyógyulási tendenciájának bemutatása a Pseudomonas aeruginosa (pa) baktérium általi fertőzés után. hiányos egerek BMCMC-k alkalmazásával 3. A bakteriális terhelés összehasonlító meghatározása a Kit +/+ - és a Kit W/Kit Wv - egerek sebében 24 órás PA-fertőzés után in vitro: 4. Az MZ PA-val történő aktiválásának vizsgálata, valamint kiválasztott komponensekkel 5. A PA közvetlen eliminációjának kvantitatív kimutatása MZ-vel együtt-tenyésztésben 6. Az MZ szekretált antimikrobiális peptidjeinek vagy proteázainak azonosítása bakteriális stimuláció után és ezek expressziójának mennyiségi meghatározása valós idejű kvantitatív PCR viii segítségével
1. táblázat Az egér nyálkahártyájának és a kötőszöveti hízósejtek tulajdonságai (Galli, 1990) Mucosa MZ (MMC) Kötőszövet MZ (CTMC) Előfordulás Bronchialis epithelium, bélnyálkahártya Bőr, tüdő, peritoneum élettartama Körülbelül 40 nap Néhány hónap - év A szemcsék ultrakonstruktúrája Nagyméretű, homogén, elektron-sűrűségű fejlődés T-sejtfüggő igen nem Igen, az emberi hízósejt-populációkban megkülönböztetik a triptáz és a kimáz, két ismert hízósejt-proteáz expressziós mintázatát. A triptáz- és kimáz-pozitív sejtek a bőrben helyezkednek el, míg a triptáz-pozitív hízósejtek dominálnak a tüdőben (Irani et al., 1986; Miller és Schwartz, 1989; Welle et al., 1997). - 4 -
A PCR-t relatív kvantifikáció alkalmazásával értékeltük a β-aktin, mint háztartási gén alapján, amellyel a stimulált és a nem stimulált minták arányát (arány) a következő képletekkel határozhattuk meg: Ratio = 2 -ΔΔCt ΔΔCt = ΔCt (stimulált) - ΔCt stimulálatlan) ΔCt = Ct (célgén) Ct (háztartási gén). A Ct érték (ciklusküszöb) leírja a PCR ciklusát, amelynél a fluoreszcencia első alkalommal jelentősen megnő. 2.10 Statisztikai elemzések A munka eredményeinek statisztikai kiértékelését a következő módszerrel hajtottuk végre: Az M átlagérték kiszámítása: M 1 nnxii 1 n Mért értékek száma xi A mért érték értéke i Az átlagérték SD szórása: SD 1 n 1 nxi M i 1 2 Standard hiba SEM des Átlagos érték: SD SEM n - 37 -
Az összes adatsor szignifikanciáját elemeztük kétoldalas Student t-teszttel nem kapcsolt minták esetében: Az érték kiszámítása: t M 2 1 1 1 SD n M 2 SD n 2 2 2 M 1: az 1. minta átlagos értéke M 2: a 2. minta átlagos értéke SD 1 az 1. populáció átlagértékeinek szórása SD 2 a 2. populáció átlagértékeinek standard eltérése 1 n 2 mért értékek száma n n 2 A 2. mintában mért értékek száma A p 0.05 valószínűségi értéke (p] nem szignifikáns megtekintett. Az összes adatot átlag ± SE-ként adtuk meg. A statisztikai elemzéseket a Statview számítógépes szoftver (Statview for Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) segítségével végeztük. - 38 -
1a. Ábra készlet +/+ (nem fertőzött) 1,5 cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Kit +/+ (fertőzött) 1,5 cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 1b ábra Kit W/Kit Wv (nem fertőzött) 1,5 1,5 cm cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Kit W/Kit Wv (fertőzött) 1,5 1,5 cm cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 4. nap 5. nap 6. nap 7. nap 8. nap 9. nap 1. ábra a/b: A Pseudomonas aeruginosa-val fertőzött MZ-hiányos egerek sebterülete megnövekszik. Ezeket a sebeket 10 μl Pseudomonas aeruginosa szuszpenzióval (PA) 6,5 × 105 PA/10 μl koncentrációban vagy 10 μl PBS-sel negatív kontrollként fertőztük, és a leírt időintervallumokban fényképeztük. Egy állat sebének bezáródását meghatározott időpontokban reprezentatív képekkel mutatjuk, azonos 1,5 cm-es skálával. 1a. Ábra vad típusú kit +/+ - egerek, 1b. Ábra MZ-hiányos készlet W/Kit W-v - egerek. - 41 -
* ** ** * * * * * * 2. ábra: A Pseudomonas aeruginosa-val fertőzött sebek sebgyógyulási folyamata késik MZ-hiányos Kit W/Kit W-v egerekben. A fertőzött Kit +/+ egereket (n = 9), a fertőzött MZ-hiányos Kit W/Kit Wv egereket (n = 6) és a megfelelő kontrollokat (n = 10 vagy n = 6) külön-külön sebekkel kezeltük a farok hátsó részén. A gyógyulást dokumentálták. Az ábra a sebgyógyulási folyamatot mutatja 9 nap alatt, ábrázolva a 0. napon lyukasztott sebek százalékos sebterületének ábrázolásával. Az adatokat 2 független kísérletből összegezzük, csoportonként n = 6-10 állattal, és átlagként ± SEM adjuk meg; * = p1 megfelel például a triptáz 1-nek LPS alatt (2,9-szer ± 1,3 SEM) és PA-nak (2,2-szeres ± 0,3 SEM), katepszin G-nek LPS alatt (2,2- alkalommal ± 1,0 SEM) és PA (1,4-szer ± 0,1 SEM), MCPT8 LPS alatt (2,6-szor ± 0,8 SEM) és PA (1,6-szor ± 0,2 SEM) ), MCPT9 LPS alatt (3,1-szer ± 1,5 SEM), valamint Granzym B LPS alatt (2,0-szer ± 0,6 SEM) és PA alatt (2,9-szer ± 1,5 SEM) . Ezzel szemben az MCPT9 expresszióját PA stimulációval csökkentették (0,7-szerese ± 0,1 SEM). Bizonyos fehérjék és proteázok lefelé történő szabályozását az értékek okozzák