A katalizált fehérjedinamika és az aggregáció szabályozza a fehérje működését Max Planck Society
Biokatalízis
1. ábra: A Pseudomonas syringae-ből származó inaktív AvrRpt2 cisztein proteázt az Arabidopsis thaliana-ból származó ROC1 peptidil-prolil-cisz/transz-izomeráz aktiválja. Mindkét fehérje Michaelis komplexeket képez, amelyekben az AvrRpt2 az ROC1 szubsztrátja, és amelyekben a katalitikus folyamat a kritikus prolil-peptid kötés reverzibilis cisz/transz izomerizációjának sebességének növekedéséhez vezet.
A Gunter Fischer által vezetett tudósok proteolitikus reakciót azonosítottak, amelyben lehetővé kell tenni, hogy összehasonlítsák az inaktív proteáz láncdinamikájának növekedését a proteáz funkció aktiválásával peptidkötés jelenlétében.-cisz/transz-Korrelál izomeráz. Ez a reakció jelző útként működik a növény immunválaszában a baktérium fertőzésére Pseudomonas syringae ismert. Az inaktív AvrRpt2 cisztein proteáz a baktériumok III. Típusú szekréciós rendszerén keresztül egy növénybe, a zsázsa falba kerül. Arabidopsis thaliana, becsempészett. ROC1, prototípusos peptidil-prolil-cisz/transz-Izomeráz in Arabidopsis, majd aktiválja az AvrRpt2 proteolitikus funkcióját oly módon, hogy bizonyos rezisztenciafehérjék most hatékonyakká válhatnak (1. ábra).
2. ábra: A Pseudomonas syringae-ből származó inaktív AvrRpt2 cisztein proteáz proteázfunkciójának aktiválását az Arabidopsis thaliana prototípusos ciklofilinnel rendelkező ROC1-gyel végezzük. Amint azt a reakcióelegyek HPLC profilja mutatja, az AvrRpt272-255 (1,0 µM) fragmentum nagyon hosszú inkubálás alatt (255 óra) szobahőmérsékleten képes megszakítani a Gly-Gly peptidkötést az Abz-IEAPAFGGWy-NH2 (y = 3-nitrotirozin) fluorogén oligopeptidben (y = 3-nitrotirozin). ne hasadjon (C). A ROC1 (10 µM) önmagában szintén inaktív (B). Ha azonban az inkubációs szakaszban mindkét fehérjét összekeverjük az oligopeptiddel, néhány másodperc múlva szinte teljes szubsztrátfogyasztás látható (csúcs 23,3 percnél) (A). A két hasítási termék: Abz-IEAPAFG-OH (csúcs 17,2 perc retenciós időnél; MW 822,9 g/mol; m/z 823,2) és H-GWy-NH2 (csúcs 15,2 perc retenciós időnél, MW 468,4 g/mol; m/z 469,1) a Gly-Gly kötés katalizált hidrolízisének eredménye. A CypA csúcs is látható.
Ezek a vizsgálatok először bizonyítják, hogy a fő lánc dinamikájának lokális növekedése indukálhatja egy fehérjét egy korábban rejtett képesség felszabadítására, itt a szubsztrát proteolízisének képességére. Ugyanakkor világossá válik, hogy ez a mechanizmus nemcsak a kémcsőben, hanem az élő sejtben is szerepet játszik, pl. B. a növények bakteriális fertőzésekre adott immunválaszában. A tudósok jelenleg folyamatban vannak az AvrRpt2 aminosav-szekvenciájában történő aktiválásáért felelős prolin azonosításán, és NMR-vizsgálatok révén megállapításokat szereznek a vonatkozó Michaelis-komplexek szerkezetéről és dinamikájáról (alkalmazottak: Cordelia Schiene-Fischer, Christian Lücke, Günther Jahreis).
Alzheimer kór
Az Alzheimer-kór a demencia leggyakoribb oka Németországban. A betegség feltehetően a rostos fehérje lerakódások - az úgynevezett amiloid fibrillák - kialakulásán alapul. Alzheimer-kórban ezek a rostok az Aβ peptidből állnak. Valószínű azonban, hogy nem a fibrillák jelentik a betegség döntő kiváltó okát, sokkal inkább azok szerkezeti prekurzorai, amelyek a képződési folyamat közbenső szakaszaként fordulnak elő. Időközben lehetővé vált ezen közbenső összeszerelési szakaszok különféle elkülönítése és biokémiai vizsgálata. Az elektronmikroszkópos felvételekben kicsi, gömb alakú struktúrákat, úgynevezett oligomereket, valamint nagyobb, rostos állapotokat láthatunk, amelyek protofibrillákként ismertek (3. ábra). Morfológiai alakjuk mellett azonban ezeknek a köztitermékeknek a pontos molekulaszerkezete sokáig rejtve maradt. A magdeburgi, lipcsei és jénai munkacsoportokkal együtt Marcus Fändrichnek sikerült részletes betekintést nyernie ezen oligomer és protofibrilláris intermedierek szerkezetébe.
Az amiloid fibrillák (balra) és különféle szerelési köztitermékek, például a protofibrillumok (középső) és az oligomerek (jobbra) elektronmikroszkóp képei. A méretarány 200 nm-nek felel meg.
A protofibrilláris és oligomer közbenső termékek felépítésének munkáját az tette lehetővé, hogy a különböző közbenső szakaszokat megfelelő eljárások alkalmazásával kellően hosszú ideig stabilizálni lehetett, és így hozzáférhetővé váltak a biofizikai kutatási módszerek számára. A protofibrilláris köztitermékek esetében ezt egy korábbi véletlen lelet révén sikerült elérni. A munkacsoport megállapította, hogy az általa izolált antitestfragmens képes beavatkozni az összeszerelési folyamat egy meghatározott lépésébe, és megakadályozni a protofibrilláris gubancok átalakulását amiloid fibrillákká. Ily módon az Aβ protofibrillákat mélyebb szerkezeti vizsgálatnak vethetjük alá, úgynevezett szilárdtestes magmágneses rezonancia spektroszkópiával. Ez a spektroszkópiai módszer lehetővé teszi a molekulán belüli egyes atomok és kémiai környezetük megfigyelését.
Fändrich és csapata megtudta, hogy mely szerkezeti elemek stabilizálják az összeszerelés közbülső szakaszait, és ezek hogyan különböznek egymástól és a felnőtt amiloid fibrilláktól a különböző köztes szakaszokban. Megállapították, hogy a köztitermékek - hasonlóan az amiloid fibrillákhoz - β-lemezes szerkezettel rendelkeznek, de ez másképp van elrendezve a későbbi összeszerelési lépésekhez képest. Az amiloid köztitermékekben a stabilizáló elemek azonosítása kritikus előfeltétele az ilyen struktúrák kialakulását megakadályozó célzott inhibitorok kifejlesztésének. Folyamatos munkájában a csoport ezért peptid alapú módszereket fejleszt ki, hogy beavatkozhasson a neurotoxikus fehérje struktúrák kialakulásának mechanizmusába. Az első eredmények ígéretesek és toxicitást semlegesítő hatást mutatnak. Hosszú távon azt remélik, hogy képes lesz új támadási pontokat vagy célstruktúrákat levezetni a terápia fejlesztéséhez.
PDI chaperonok és kliens fehérjék
Az ERp46 abban különbözik az ERp29-től, hogy redoxi reakciókban katalitikus funkciót képes ellátni. Különböző glükózkoncentrációk esetén a hasnyálmirigy-szövet Langerhans-szigeteinek ß-sejtjeiben másképp expresszálódik, és az adiponektin-szignálok szabályozására is szolgálhat. Az ERp29 és ERp49 kötési tulajdonságainak különbsége nyilvánvaló a fent említett peptid könyvtárakban. Ebből arra következtettek, hogy az ERp46 két különböző ponton léphet kölcsönhatásba az ERp29-gyel. Ezen kölcsönhatások molekuláris jobb megértése érdekében az ERp46 harmadik doménjét (a´ domén) kristályosítottuk. Ebben a kontextusban érdekes, hogy az ERp29-hiányos egerekben az ERp46 fel van szabályozva, és ezzel egyidejűleg a zsírsav-anyagcserét szabályozó fehérjék is érintettek. E kapcsolatok tesztelésére az ERp29 knock-out egereket magas zsírtartalmú étrendnek vetették alá, és elemezték, hogy képesek-e felvenni a vér glükózját (4d. Ábra). Míg a vad típusú egerek szignifikánsan csökkent felvételi profilt mutattak, ami a cukorbetegségben a glükóz intoleranciára jellemző, addig az ERp29 knock-out egereknél szignifikánsan javult profil található (P.