A keratinociták apoptózisa együtt jár a cd8 limfociták beszűrésével és a felhalmozódással
alanyok
absztrakt
A szövetminták immunopatomorfológiai festése lehetővé teszi a morfológiai részletek, fenotípusok és az aktivációs markerek jelenlétének mikroszkópos értékelését az infiltráló sejtekben. A limfociták, főleg CD8 + jelenléte a bőr hámsejtjei közelében1 és az egysejtű apoptózis jelenléte az akut GVHD-t jelzi. 23 A bazális sejtek nukleoláris szervező régiói (NOR) erősen festődnek a bőr biopsziáiban. A GVHD akut felhalmozódása .4-NORs jellemzi a sejteket a sejtciklusban.5 Ezt akut GVHD elváltozások esetén a bőr keratinocitáinak megnövekedett proliferációs sebességének jeleként értelmezték. A NOR felhalmozódása azt mutatja, hogy a sejtek a sejtciklusban vannak, de ez nem biztos, hogy sikeres mitózissal fejeződik be. Ha a sejtosztódás nem fejeződik be, a folyamat apoptózissal végződik
Jelen munkában összefüggést vizsgáltunk a limfocita infiltráció mértéke és a Ki67 + és apoptotikus sejtek jelenléte között akut GVHD betegek bőrbiopsziáiban. Ezenkívül értékeltük a keratinociták PCNA, ciklin A és sejtosztódási ciklus 2 (cdc2) pozitivitását. Ez a komplex elemzés kimutatta a keratinocyták növekedési ciklusának károsodását a BMT után szenvedő betegeknél, ami valószínűleg elősegíti a helyi CD8 + sejtek infiltrációjának mértékével járó apoptotikus folyamatokat.
Betegek és módszerek
Türelmes
Tizennyolc (10 felnőtt és 8 gyermek) krónikus myeloid leukémiában (n = 6), akut leukémiában és myelodysplasticus szindrómában (n = 7), aplastikus anaemiában és Fanconi anaemiában (n = 5) azonosítottak BM-t (12 beteget) vagy PBPC-vel (5 beteg). Egy beteg (CML) PBPC-t kapott az édesanyjától (alternatív donor transzplantáció) (1. táblázat).
A kondicionáló séma 4 mg/testtömeg-kilogramm buszulfánt (BU) és 50 mg/testtömeg-kg ciklofoszfamidot (CY) tartalmazott, 4 napon át (teljes dózis 16 mg/testtömeg-kg és 200 mg/testtömeg-kg BU vagy CY) nyolc leukémiás beteg számára. standard rizikóval vagy 4 mg/testtömeg-kg BU-val 4 nap alatt (teljes adag 16 mg/testtömeg-kg) és 60 mg/kg CY-vel 2 nap alatt (teljes adag 120 mg/testtömeg-kg), kiegészítve 5-15 mg/ttkg etopoziddal 2-ben Napok (teljes dózis 10–30 mg/ttkg) vagy 250 mg/m 2 tiotepa 3 nap alatt (teljes dózis 750 mg/m 2) három vagy két alacsony kockázatú betegnél. Az FA-esetek 5–15 mg/testtömeg-kg anti-timocita globulint (ATG, Fresenius, Bad Homburg, Németország) kaptak 5 egymást követő napon keresztül (teljes adag 25–75 mg/testtömeg-kg) és 20 mg/kg CY-t adva 4 nap (teljes dózis 80 mg/testtömeg-kg). Az SAA-betegek 50 mg/testtömeg-kg dózisban kaptak CY-t 4 nap alatt (teljes adag 200 mg/testtömeg-kg) és 5 mg/testtömeg-kg ATG-t 5 nap alatt (teljes dózis 25 mg/testtömeg-kg) (1. táblázat).
Az akut GVHD-profilaxis a ciklosporin A-t (CsA) tartalmazta a szérumszint 100 és 200 ng/ml közötti csökkentésére, valamint a metotrexátot (MTX) 10 mg/m 2 vagy 5 mg/m 2 dózisban (csak SAA-betegeknél) napokon + Érje el az 1, +3, +6 és +11 értékeket. Az MTX-t két esetben abbahagyták nyálkahártya vagy máj toxicitás miatt. A toxicitást a WHO standard kritériumai szerint értékelték. Az akut GVHD tünetek a prednizon-kezelés megkezdését késztették 2 mg/testtömeg-kg dózissal, amelyet 2 napos időközönként növeltek, ha nem történt reakció.
Négy esetben (15-49 év közötti) normál bőrből készült biopsziákat alkalmaztak, amelyeken nem malignus és nem gyulladásos betegségek miatt végeztek mellkasműtétet, kontrollként a növekedési ciklus marker vizsgálatához. A nyirokcsomók metasztatikus elváltozásokkal történő jelölése dokumentálta a ciklin A, cdc2 és Ki67 antitestek képességét a sejtek kimutatására a sejtciklusban (nem látható).
Mód
A bőr biopsziáit a bőrelváltozások első jelei előtt vagy másnap (egy eset kivételével) a prednizon beadása után vették (1. táblázat).
A H + E-vel festett metszeteket az akut GVHD7 és apoptotikus elváltozások közzétett kritériumai szerint pontoztuk.8 A mononukleáris sejtek infiltrációját a következőképpen értékeltük: kevesebb, mint öt sejt egy klaszterben, 0. fokozat; 6–20 sejt egy klaszterben, 1. fokozat; 21-50 sejt egy klaszterben, 2. fokozat; Egy fókusz több mint 50 sejtet tartalmaz egy klaszterben, 3. fokozat, és több mint egy sejtet a szövetben, 4. fokozat.
Statisztikai analízis
Az eredmények statisztikai értékeléséhez a párosított minták Mann-Whitney U tesztjét, Fisher pontos tesztjét és Student t tesztjét használtuk.
Eredmények
Szekvenciális bőrbiopsziák (fagyasztott szakaszok) szteroidrezisztens akut GVHD-ben szenvedő páciensektől (UPN 88). Mind a Ki67 + hámsejtek, mind az apoptotikus sejtek száma megnőtt, amikor az akut GVHD teljesen megnőtt (+17 nap a BMT után +31 nappal), és a végstádiumban ismét csökkent. Akut GVHD (+45 nappal a BMT után) (eredeti nagyítás × 400) .
Akut GVHD III fokozatú paraffin blokkolja a sejtciklushoz kapcsolódó fehérjék és apoptotikus sejtek festését. Felhívjuk figyelmét, hogy a Ki67 antigén, a PCNA és a ciklin A felhalmozódott a megnagyobbodott sejtmagokban, a Cdc2-pozitív sejtek hiánya és számos apoptotikus sejt hiányzik a hám alaprétegében (eredeti nagyítás × 400).
Megszámoltuk a Ki67 pozitív sejteket, és értékeltük a festés mértékét. A Ki67 + sejtek frakciója az epidermisz bazális rétegében hasonló volt mindkét mintában apoptotikus sejtekkel és anélkül is (medián értékek: 0,25 vs. 0,2). A Ki67 + festés azonban sokkal erősebb volt a szövetszakaszokban, apoptotikus sejtekkel. A sejtmagok nagyobbak voltak és erősebben jelölték Ki67 MoAb-vel, mint az apoptózis nélküli biopsziák (1. és 2. ábra). Ez a kép kilenc mintából hétben volt látható apoptotikus sejtekkel, és csak minden kilenc szöveti szakaszban volt látható apoptózis nélkül (P = 0,008) (4. táblázat).
A szekvenciális bőrbiopsziák azt mutatták, hogy az akut GVHD előrehaladtával mind a Ki67 +, mind az apoptotikus sejtek száma nőtt. Az előrehaladott akut GVHD Ki67 + sejtjeit fokálisan csoportosítottuk. Az akut GVHD végstádiumban a Ki67 + és az apoptotikus sejtek is csökkentek, miközben az epidermális sejtek száma csökkent (1. ábra). A PCNA festés követte a Ki67 mintázatát, amely toxikus elváltozású biopsziákban valamivel kevesebb volt, szemben az akut GVHD bőrrel (nem látható).
A betegeket a TUNEL festési eredmények szerint csoportosítottuk (1. táblázat). Az 1. csoportba apoptotikus sejteket és a 2. csoportba tartoztak azok a betegek, akiknek a bőrbiopsziájukban nem voltak apoptotikus sejtek. A bőrbiopsziában apoptotikus sejtekkel rendelkező betegek idősebbek voltak, mint az apoptotikus sejtek nélküli betegek (átlag ± fél: 24, 8 ± 3, 7 vs. 15, 2 ± 3, 4 év; P = 0,042), és gyakrabban kaptak toxikusabb kondicionálást, amelyhez az etopozid vagy a tiotepa tartozott (4/9) vs 1/9, NS) (1. táblázat). Mindkét tényező hozzájárulhatott ahhoz, hogy a toxikus nyálkahártya-szövődmények gyakrabban forduljanak elő az 1. csoportban, mint a 2. csoportban (P = 0,013) (1. táblázat). Az apoptotikus sejtek pozitív bőrfestésével rendelkező összes beteg (1. csoport) megfelelt az akut GVHD szövettani és klinikai kritériumainak. Akut GVHD stádiumban is fejlettebbek voltak, mint a 2. csoportba tartozó betegek (P = 0,015) (1. táblázat).
Hat akut GVHD-t, két toxikus elváltozású bőrbiopsziát és négy kontroll bőrmintát lehetett vizsgálni a növekedési ciklushoz kapcsolódó fehérjefestés szempontjából paraffin blokk szakaszokban. Mind a nyolc mintában (függetlenül attól, hogy akut GVHD vagy toxikus elváltozásuk volt-e) a ciklin A-pozitív sejtek gyakorisága magasabb volt, mint a cdc2-pozitív sejteké (32% versus 8%; P = 0,072) (2 ) ellentétben a normál bőrrel, amelyet a ciklin A- és cdc2-pozitív sejtek hasonló aránya jellemzett (3). A ciklin A-pozitív és a cdc2-pozitív sejtek prevalenciáját akut GVHD-s biopsziákban figyelték meg, függetlenül a TUNEL festés eredményeitől. A ciklin A felhalmozódását azonban mind a négy biopsziában megfigyelték apoptotikus sejtekkel, de normális vagy beteg bőrben apoptotikus sejtek nélkül (nyolc biopszia) (2 és 3). A ciklin A festési minta hasonló volt a Ki67 mintázatához. Ugyanezt figyeltük meg az A ciklinnél is, amikor a Ki67 fehérje felhalmozódott (2).
A normál bőr paraffin blokk szakaszai a 2. ábrán leírtak szerint festődnek. Meg kell jegyezni, hogy a PCNA prevalencia a Ki67 + sejtekhez képest pozitív, hogy a ciklin A- és Cdc2-pozitív sejtek egyenlő arányban vannak jelen, és hogy a felső hámréteg barnás (apoptotikus sejteket fest) az apoptózis magjai (eredeti Nagyítás × 400).
vita
Az apoptotikus sejtek száma alacsony volt, és azokat olyan betegeknél figyelték meg, akiknél kifejezettebb nyálkahártya és/vagy bőrtoxicitás volt. Összekapcsolódtak az akut GVHD súlyosságával és a limfociták beszivárgásának mértékével a bőrben, de nem a limfociták jelenlétével az epidermiszben. Az apoptózis tehát része a teljes értékű akut GVHD képének, amely magában foglalja a szövetkárosodást és a limfocita infiltrációt (2. táblázat).
Úgy tűnik, hogy a betegek bőrkárosodása a BMT után két lépésből áll. A genotoxikus sértés kezdetben befolyásolja a sejtciklust, és hibához vezet a G 2/M határán. A Ki67- (2. ábra) vagy az AgNOR-pozitív sejtek viszonylag magas aránya ellenére ez alacsony kerotociták mitotikus sebességéhez vezet.4 Ez a helyzet a sejteket hajlamossá teszi apoptotikus halálra. A végső apoptotikus találat keratinocitákba juttatásának mechanizmusa a jelen tanulmányból nem vezethető le, de valószínűleg összefügg a limfocita infiltrációval. Ennek oka inkább a gyulladásos citokinek helyi felszabadulása lehet, amelyeknek (például TNFα) növekedési megállító képességük lehet22, de nem közvetlen enzimfüggő limfocita támadásnak. A Granzyme apoptotikus halált indukál és cdc2 kináz 19 aktivitást igényel, de úgy tűnik, hogy a BMT után nincs a bőrben.