A kináz aktivitású fehérjék azonosítása - Ember - Élelmiszer - Környezet
elv
Humán foszfo-MAPK tömb és -RTK tömb az aktivált mitogénnel aktivált protein kinázok (MAPK), a tirozin kinázok (RTK) és más szerin/treonin kinázok relatív foszforilációs szintjének meghatározására
Az intracelluláris jelátviteli kaszkádok közül a mitogén-aktivált kinázok
Humán foszfo-MAPK tömb készlet több foszforilált kináz kimutatására kezelt és kezeletlen sejtekben.
A protein-kináz család (MAPK) központi szerepet játszik. A MAPK család számos szerin/treonin kinázt kombinál, például ERK-1 (p44MAPK), ERK-2 (p42MAPK), Jun N-terminális kinázokat és p38-MAPK. A sejt stimulálása például mitogén faktorokkal általában a MAP kináz aktivitás növekedéséhez vezet. Az ERK-1 és -2 például transzlokálódik a sejtmagba, és aktiválja a transzkripciós faktorokat, ami ezt követően sejtproliferációhoz vagy sejtdifferenciálódáshoz vezet, míg a MAPK gátlása gátolja ezeket a folyamatokat. Ezeknek a kinázoknak a konstitutív aktiválódásával kontrollálatlan sejtnövekedés léphet fel, amely fontos szerepet játszik a tumorgenezisben. Hasonlóképpen, a megnövekedett ERK-aktivitás a tumor megnövekedett invazivitási és metasztázis-potenciállal jár.
Ezeket a kinázokat különféle receptor ligandumokkal lehet aktiválni, ezáltal az ERK1/2 aktiváció receptor tirozin kináz által közvetített mechanizmusát jól jellemzik. A receptor tirozin kinázok (RTK) fontos közvetítői az olyan fiziológiai sejtfolyamatoknak, mint a proliferáció, differenciálódás, mozgékonyság vagy a sejtek túlélésének szabályozása. Az RTK magában foglalja az epidermális növekedési faktor (EGF) és az inzulinreceptort. Amikor egy receptor ligandum az RTK specifikus kötődési helyéhez kötődik, megváltozik a konformáció és az azt követő dimerizáció. Ez a két monomer transzfoszforilezéséhez vezet. Az aktivált receptor foszforilezett tirozin-maradékai kikötőpontot képeznek az adaptív fehérjék számára, amelyek ezután képesek elindítani egy protein-kináz kaszkádot. Ez az elv más receptor tirozin kinázoknál is megfigyelhető.
A humán foszfo-MAPK tömb és a humán foszfo-RTK tömb segítségével nagyszámú szignálmolekula foszforilációs státusza, valamint a receptor foszforilációja mérhető a szignál transzdukciós folyamatban. Ezeknek a tömböknek az előnye a rögzített MAP kinázok és RTK-k nagy száma:
Felvett MAPK (21 MAPK):
ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, JNK3, JNK-pan, p38-α, p38-b, p38-g, p38d, RSK1, RSK2, GSK-3a, GSK-3b, Akt1, Akt3, Akt2, Akt pan, MSK1, MSK2, HSP27, p70 S6 kináz
Fogott RTK (42 RTK):
EGFR, ErbB2, -3, -4, FGFR1, -2a, -3, -4, InsulinR, IGF1-R, Axl, Dtk, Mer, HGFR, MSPR, PDGFRa, -ß, SCFR, Flt-3, MCDFR, c-Ret, ROR1, -2, Tie-1, -2, TekA, -B, -C, VEGFR1, -2, -3, MuSK, Epha1-7, EphB1-6
A mérés elve
A kináz-specifikus antitesteket dublettekként foltozzuk meg egy nitrocellulóz membránon, és az előkészített sejtlizátummal inkubáljuk, a foszforilezett kinázok kötődnek a foltos antitestekhez. A 21 specifikus kináz elleni antitestek „koktélját”, amelynek végéhez biotin kapcsolódik, pipettázunk minden foltra. Mindegyik folthoz egy immobilizált antitestek, kináz és az antitest-biotin komplex többrétegű rétege jön létre „molekuláris szendvics” formájában. A tényleges detektálási reakció ezután sztreptavidin-HRP hozzáadásával és a kemilumineszcencia detektálásával megy végbe.
Próbaértékelés
A sejteket 15 percig szubsztráttal kezeltük, vagy kezeletlenül hagytuk. Miután a sejtlizátumot elkészítettük és az antitestekkel inkubáltuk, kemilumineszcencia segítségével detektáltuk. A digitalizált képeket ezután denzitometriásan értékelik, és a pixel intenzitást grafikusan jelenítik meg.
költségek
Kb. 380 euró 4 mintához a 21 MAPK egyidejű meghatározásához
Kb. 450 euró 4 mintára a 42 RTK egyidejű meghatározásához
Alkalmazási példa (általános)
Az élelmiszer-összetevők szabályozó hatása a szignálfehérjék vagy receptorok foszforilációjára az immunválasz összefüggésében (Wang et al. 2007 és Stehphen et al. 2007), valamint a tejoligoszacharidok hatása a jelátalakító folyamatokra (Kuntz et al. 2009).