A klinikailag releváns Clostridium difficile R20291 törzs cefoperazonnal kezelt egérmodellje

Összegzés

Ez a protokoll leírja a Clostridium difficile fertőzés (CDI) egér cefoperazon modelljét, klinikailag releváns és genetikailag kezelhető törzs, R20291 alkalmazásával. A protokoll részletezi a C. betegség klinikai megfigyelésének, a nehéz baktériumszámlálásnak, a toxin citotoxicitásának és a CDI-n átívelő hisztopatológiai változások hangsúlyozását egérmodellben.

Bevezetés

A Clostridium difficile egy anaerob, Gram-pozitív spóraképző bacillus, amely életveszélyes hasmenést okoz 1. A C. difficile fertőzés (CDI) fokozott emberi morbiditással és mortalitással jár, és több mint 4,8 1-4 milliárd dolláros egészségügyi költséget eredményez. évente. 2013-ban a Betegségellenőrzési és Megelőzési Központok a C. difficile-t az antibiotikum-rezisztencia sürgős kockázatának minősítették, jelezve, hogy sürgős veszélyt jelent a közegészségügyre. 1. Jelenleg a vankomicin és a metronidazol antibiotikum-kezelése a CDI ellátásának standard standardjának tekinthető 5 Sajnos a sikeres antibiotikum-kezelés után a CDI megismétlődése magas, a betegek 2,5-7 éves korának 20-30% -ában fordul elő. Ezért új terápiás szerek felfedezése szükséges ezen enterális kórokozó ellen. A C. difficile elleni terápia értékeléséhez a humán AC betegséghez közeledő állatmodellre van szükség linikailag releváns törzsre.

Először is, Koch posztulátumát 1977-ben hozták létre a C. difficile esetében egy klindamicinnel kezelt szíriai hörcsög 8. modell alkalmazásával. Ezt a modellt ma is alkalmazzák a C. difficile toxinok patogenezisre gyakorolt ​​hatásainak tanulmányozására. A hörcsögmodellben a CDI azonban magas halálozási arányt eredményez, és nem közelíti meg a krónikus alattomos betegség megnyilvánulásait, amelyek a CDI 10,11-es embereknél tapasztalhatók. Az adaptív egérplatformok hozzáférhetősége és elérhetősége alapján releváns a CDI egérmodell keresése.

2008-ban létrehozták a CDI robusztus egérmodelljét úgy, hogy az egereket 3 napig ivóvízben (kanamicin, gentamicin, kolisztin, metronidazol és vankomicin) tartalmazó antibiotikum koktéllal kezelték, majd a klindamicin 12 intraperitoneális injekcióját követték. fogékony a CDI-re és a súlyos vastagbélgyulladásra. A beadott oltóanyag dózisától függően számos klinikai tünet és letalitás figyelhető meg ezzel a modellel. Ettől az időponttól kezdve különféle antibiotikus kezeléseket tanulmányoztak, amelyek módosítják az egér bél mikrobiotáját, csökkentve a kolonizációval szembeni ellenállást addig a pontig, ahol a C. difficile képes kolonizálni a gyomor-bél traktust (áttekintve Best et al. And Lawley & Young) 13.14.

Újabban egy széles spektrumú cefalosporin, cefoperazon, 5 vagy 10 napig ivóvízben adva, reprodukálhatóvá teszi az egereket a CDI-re fogékonyaknak. Mivel a harmadik generációs cefalosporinok beadása a CDI emberben fokozott kockázatával jár, a cefoperazon A modell jobban tükrözi a természetesen előforduló betegséget 16. A C. difficile-re fogékony cefoperazonnal kezelt egereket mind a C. difficile spórákkal, mind a vegetatív sejtekkel kiváltották különböző klinikai törzsekből, relevanciájuk és virulenciájuk között. 17. A vegetatív C. difficile sejteket alkalmazó eredeti vizsgálatok ellenére fertőző, C. difficile spórák az átvitel elsődleges módjának tekinthető 18.

Az elmúlt évtizedben megjelent a C. difficile R20291, a/BI/027 NAP1 törzs, amely a CDI 19,20 járványait okozta. Arra törekedtünk, hogy meghatározzuk a betegség klinikai lefolyását, amikor a cefoperazonnal kezelt egereket a klinikailag releváns és genetikailag kezelhető C. difficile R20291 törzsnek tették ki. Ez a protokoll részletezi a C. difficile R20291 spórákkal fertőzött egerek klinikai lefolyását, beleértve a fogyást, a baktériumok kolonizációját, a toxin citotoxicitását és a hisztopatológiai változásokat a gyomor-bél traktusban. Összességében ez az egérmodell értékes kísérleti platformnak bizonyul a CDI-hez, amely megközelíti az emberi betegséget. Ez a jellemzett egérmodell tehát felhasználható az új terápiák hatásának felmérésére a klinikai betegség javítására és a C. difficile elleni kolonizációs rezisztencia helyreállítására.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Etikai megállapítás:
Az Észak-Karolinai Állami Egyetem Állatorvostudományi Főiskoláján (NCSU) az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság (IACUC) jóváhagyta ezt a tanulmányt. Az NCSU állatgondozási és -használati politikája betartja az 1985. évi laboratóriumi állatjóléti és egészségügyi kutatások kiterjesztéséről szóló törvényben megállapított szabványokat és irányelveket. Az NCSU állattartó létesítményei betartják a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatóban meghatározott irányelveket. Egészségügyi feltételek Az állatokat naponta értékeltük, és a romboló állatokat emberségesen eutanizáltuk CO2 fulladással, majd másodlagos intézkedésekkel. képzett állattechnikusok vagy állatorvos végzett tenyésztést az AAALAC akkreditált létesítményében e vizsgálat során.

1. A cefoperazon antibiotikum beadása ivóvízben a C. difficile iránti fogékonyság elérése érdekében Kolonizáció és betegség

MEGJEGYZÉSEK:/6 WT egeret 5-8 hetes korban (nőstény és hím) C57BL-t vásároltak és karanténba helyezték 1 hétig az antibiotikum víz beadásának megkezdése előtt. Karantén után az egereket autoklávozott táplálékkal, ágyneművel és vízzel helyezték el. A ketreccseréket a laboratóriumi személyzet hetente végezte el egy lamináris áramlású csuklyában.

  1. Készítsük el a cefoperazont (0,5 mg/ml) steril desztillált vízben 7 nappal a megcélzás megkezdése előtt (1.ábra).
  2. Töltse fel az autoklávozott vizes palackokat cefoperazon vízzel (0,5 mg/ml), és helyezze mindegyik egérketrecbe.
    MEGJEGYZÉS: Frissen elkészített cefoperazon vizet kell készíteni és 2 naponta cserélni 5 napos időtartamra, az 1.1. És az 1.2. Lépésben leírtak szerint. A cefoperazon víz megfelelő ártalmatlanítása ajánlott az intézményi környezetvédelmi és biztonsági irányelvek betartásával.
  3. 5 nap után cefoperazon vízzel cserélje le a palackokat steril desztillált vízzel töltött autoklávozott vizes palackokra. Adja meg az egeret és az ivóvizet a kísérlet időtartama alatt.

2. C. difficile spóra oltóanyag előkészítése és egerek szoptatása

MEGJEGYZÉS: Indulás előtt ellenőrizze, hogy az anaerob kamrában legalább 24 órára a következőket helyezik el: 1x foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS; lásd: Anyagok), cikloserin-taurocholate-cefoxitin-fruktóz-agar (TCCFA) lemezek (lásd: Anyagok és a kiegészítő fájl) és egy steril L alakú övvisszahúzó.