A koleszterin hatása a tengerimalac-cochlea külső szőrsejtjeinek mozgékonyságára

A koleszterin hatása a tengerimalac-cochlea külső szőrsejtjeinek mozgékonyságára és a motorfehérje presztinre Johannes Michael Schmid

A müncheni Ludwig Maximilians Egyetem fül-, orr- és torokgyógyászati klinikájáról és poliklinikájáról igazgató: Prof. Dr. med. Alexander Berghaus A koleszterin hatása a tengerimalac-cochlea külső szőrsejtjeinek mozgékonyságára és a motoros fehérje Prestin Disszertációra a müncheni Ludwig Maximilians Egyetem Orvostudományi Karának orvosi doktori fokozatának megszerzéséhez 2011-ben, a müncheni Johannes Michael Schmid előadásában

A MÇncheni Egyetem Orvostudományi Karának jóváhagyásával Előadó: Társelőadó: Priv.-Doz. Dr. med. M. Canis Prof. Dr. GÉtz Magdalena Prof. Dr. Frank Staub Dean: Prof. Dr. med. Dr. h.c. M. Reiser, FACR, FRCR Szóbeli vizsga napja: 2011.06.09

I Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék I. oldal. Bevezetés. 1 1. A hallás fontossága. 1 2. A belső fül anatómiája. 2 3. A csiga élettana. 5 3.1 Hangátvitel és tonotópia. 5 3.2 Endokochleáris potenciál és mechanoelektromos transzdukció. 5 3.3 A jel erősítése a külső szőrsejtek által. 7 3.4 Információ továbbítása a belső szőrsejteken keresztül. 11 4. Motorfehérje presztin és a külső szőrsejtek sejtmembránjának finom szerkezete. 11 4.1 A Prestin azonosítása. 11 4.2 A külső szőrsejtek sejtmembránjának finom szerkezete. 12 4.3 A presztin szerkezeti felépítése és lokalizációja. 13 4.4 A Prestin funkciója. 15 5. A külső szőrsejtek nemlineáris kapacitása és elektromotilitása. 16 6. A koleszterin és hatása a hallás folyamatára. 17 6.1 Kémiai szerkezet és általános jelentés. 17 6.2 A koleszterin jelentősége a plazmamembrán szempontjából. 19 6.3 A koleszterin hatása a belső fülre. 20 7. Kérdések és célok. 24 II. Anyag és módszerek. 26 1. Anyag. 26 1.1 Eszközök. 26 1.2 Fogyóeszközök. 27 1.3 Vegyszerek és oldatok. 27 1.3.1 Vegyszerek. 27 1.3.2 Megoldások. 28 1.4 Szoftver. 29.

III Tartalomjegyzék 2. A külső szőrsejtek mozgékonysága fiziológiai körülmények között. 53 3. A koleszterin hatása a külső szőrsejtek mozgékonyságára. 55 3.1 Általános szempontok. 55 3.2 A külső szőrsejtek mozgékonyságának függése a koleszterin koncentrációjától. 56 3.2.1 A koleszterin hatása a maximális rövidítésre és a maximális meghosszabbításra. 56 3.2.2 A koleszterin hatása a legnagyobb meredekségre, az átlagos hosszváltozásokra és a V pkc feszültségre. 58 3.3 A koleszterin hatása a motor fehérje presztinre és a külső szőrsejtek sejtmembránjára. 60 3.3.1 A klorid hatása a külső szőrsejtek mozgékonyságára. 60 3.3.2 A koleszterin hatása a fele-maximális presztin funkcióval. 62 V. Összegzés és kitekintés. 64 VI. Rövidítések listája. 68 VII. Ábra lista. 69 VIII. Táblázatok. 71 IX. Bibliográfia. 72 X. Köszönetnyilvánítás. 78 XI. Publikációk. 79 XII. Önéletrajz. 81.

I. Bevezetés 4 1. ábra: A belső fül anatómiája A: Áttekintés vágott nyitott csiga B-vel: Keresztmetszet a csiga tekercsén keresztül C: A Corti szervének sematikus ábrázolása a külső és belső szőrsejtekkel (módosítva Hudspeth 2000 és Knirsch 2007-ből) (Knirsch 2007 )

7 I. A bevezetés -60 mv és -80 mv között ingadozik (Rajagopalan et al. 2007) (3. ábra). Ezeknek az ionáramoknak a mozgatórugója a hajsejtek membránpotenciálja és az endokochleáris potenciál közötti potenciális különbség (Klinke és mtsai 2005; Schmidt 2007; Speckmann és mtsai 2008). 3. ábra: Receptorpotenciál a sztereovillusok elhajlásának függvényében (módosítva: Speckmann és mtsai. 2008 és Rajagopalan és mtsai. 2007). 3.3 Jelerősítés a külső szőrsejtek által Az ionok beáramlása az ETC-be és a kapcsolódó potenciálváltozások aktiválják a ÄHZ (Breneman et al. 2009). Ez a megerősítési funkció két mechanizmuson alapszik, a szomatikus és a csilló mozgáson. Mindkét mechanizmus az EHZ aktív mozgásával akár 1000-szeresére növeli a haladó hullám rezgéseit (Schmidt 2007; Dallos 2008). Ciliáris motilitás esetén ez a sztereovillák aktív mozgásain keresztül történik, míg a szomatikus mozgás a sejttest meghosszabbításán és rövidülésén alapul. Ez a cochleáris erősítő néven ismert mechanizmus növeli a hallószerv frekvenciaszelektivitását és érzékenységét. Az ÄHZ ototoxikus anyagok

I. Bevezetés 10 5. ábra: Ciliáris mozgás (módosítva Fettiplace 2006-ból és Breneman et al. 2009-ből) A jelenlegi kutatási eredményeket összefoglalva Hudspeth azt javasolta, hogy a ciliarus mozgás egyfajta előerősítőt és frekvenciamodulátort képviseljen, míg a szomatikus mozgás végső erősítőként működik tudott (Hudspeth 2008). A cochleáris erősítő dinamikusan működik. Lehetőséget kínál a nagyon alacsony hangintenzitások erősítésére, miközben a nagy hangintenzitásokat erősítés nélkül dolgozzák fel. Ez megakadályozza a belső fül károsodását. Az automatikus erősítés gátló hatások formájában biztosítja a mechanikai egyensúlyt. A legjobban kutatott gátló hatást az acetilkolin neurotranszmitter közvetíti. Az acetilkolin az efferens szálak fő közvetítője, amelyek beidegzik az EHZ-t. Specifikus receptorokhoz kötődve a Ca 2+ áramlik a sejtbe. Ez késleltetett K + kiáramláshoz és így a sejt hiperpolarizációjához vezet. Ez az ETC feszültségérzékenységének csökkenéséhez és az elektromotilitás gátlásához vezet (Frolenkov 2006; Ashmore 2008).

12 I. Bevezetés. Liberman és mtsai. megerősíteni tudták ezt az elméletet 2002-ben. Megmutatták, hogy amikor a kódoló gén 3-7 exonját törölték, az egereknél elvesztették az otoakusztikus emisszió (DPOAE) és az EHZ elektromotilitásának torzulási termékeit, valamint a hallási küszöböt 40-50 dB-rel növelték (Liberman és mtsai 2002). 4.2 A külső szőrsejtek sejtmembránjának finom szerkezete A motoros fehérje presztin szinte kizárólag az ÄHZ laterális sejtmembránjában található meg (Ashmore 2008) (6. ábra). 6. ábra: A külső szőrsejt laterális sejtmembránjának szerkezete (módosítva: Oghalai et al. 1998). Az ETC csúcsos végén a sztereovillusok a kutikuláris lemezhez kapcsolódnak. A sejtmag a sejt tövében van. Az oldalfal sejtmembránja egyedülálló háromrétegű szerkezettel rendelkezik. A külső réteg a plazmamembrán (PM), amelyben µm²-enként 3000–6000 presztinmolekula van beágyazva. A presztinsűrűség az ETC elhelyezkedésétől függ a csigában. Apikális EHZ, hogy a

I. Bevezetés 14 A Prestin háromdimenziós rekonstrukciója Mio és mtsai. 7,7 nm x 7,7 nm x 11,5 nm méretű fehérjét eredményezett golyó alakú pisztoly formájában, belső üregekkel (Mio és mtsai 2008) (8. ábra). 7. ábra: A presztin szerkezetének és lokalizációjának sematikus ábrázolása a külső szőrsejtek plazmamembránjában (módosítva Ashmore 2008-ból) 8. ábra: A presztin háromdimenziós ábrázolása a plazmamembránban (módosítva: Mio et al. 2008)

17 I. Bevezetés Összehasonlítás az ÄHZ hosszának változásainak vizsgálataival más módszerekkel, pl. az ebben a munkában használt videomikroszkópia (Ashmore 2008). 10. ábra: Az NLC, a töltésmozgás és a hosszváltozás grafikus ábrázolása a membránpotenciál függvényében (módosítva Ashmore 2008-ból) Számos tényező, mint pl. az intracelluláris fehérjék vagy olyan anyagok, mint a kloroform, a gadolinium, a szalicilátok vagy a koleszterin, foszforilációs állapota befolyásolhatja ezeket a folyamatokat. Ezeket a görbéket eltolhatja a depolarizáló vagy a hiperpolarizáló irányba, vagy megváltoztathatja a legnagyobb hosszváltozás vagy a legnagyobb töltésmozgás mértékét. Ebben a munkában a koleszterin hatását vizsgálták az EHZ mozgékonyságára (Ashmore 2008). 6. A koleszterin és hatása a hallási folyamatra 6.1 Kémiai felépítés és általános jelentés A Nobel-díjas Michael Brown a koleszterint Janus-fejű molekulának nevezte (Berg et al. 2007). Egyrészt sejtjeink nélkülözhetetlen része, másrészt károsítja az emberi szervezetet pl. érelmeszesedés miatt (Yeagle 1985). A koleszterin a legtöbb plazma membrán lényeges részét képezi

25 I. Bevezetés Annak érdekében, hogy meg lehessen különböztetni a koleszterint a sejtmembránon és a motoros fehérje presztinnen, az ETC presztinfunkcióját csökkenteni kell az intracelluláris klorid koncentrációjának körülbelül 50% -ra történő csökkentésével (Oliver et al. 2001). Az ETC-ket, amelyek fele a prestin funkcióval rendelkezik, ezután két tesztcsoportra osztják. Az első csoportot 1,0 mmol/l extracelluláris koleszterin-koncentrációval vizsgáljuk, a második csoportot hozzáadott koleszterin nélkül. Ezeknek a kísérleteknek az értékelése megválaszolja azt a kérdést, hogy a koleszterin hatása inkább a sejtmembrán passzív tulajdonságaira gyakorolt hatások eredménye-e, vagy inkább a motoros fehérje presztin működésére gyakorolt hatáson alapszik.

II. Anyag és módszerek II. Anyag és módszerek 1. Anyag 1.1 Berendezés előkészítése Sztereomikroszkóp hideg fényforrás Az oldatok elkészítése Wild M3C KL 1500 elektronikus fagyáspont ozmométer Osmomat 030 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Németország Schott AG, Mainz, Németország Gonotec GmbH, Berlin, Németország Pipetták Referencia Hamburg, Eppendorf AG, Patch Clamp Stimulációs Üvegelektróda Puller Patch Clamp Table/Faraday Cage Patch Clamp Erősítő Patch Pipetta tartó/Előerősítő DMZ Universal Puller Micro-g Axopatch 200A CV-201A állvány Németország Zeitz Instruments GmbH, Martinsried, Németország TMC, Peabody, MA, USA Axon Instruments Inc., Foster City, Kalifornia, USA Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA

27 Analóg-digitális átalakító Digidata 1200 mikromanipulátor XR-6 modell Videofelvételek Mikroszkóp Axiovert 135 Videokamera Moticam 2000 II. Anyag és módszerek Axon Instruments Inc., Foster City, Kalifornia, USA Narishige Scientific Instrument Lab., Tokió, Japán Carl Zeiss AG, Göttingen, Németország Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Németország 1.2 Fogyóeszközök pipetta hegyekhez 10 µl, 100 µl, 1000 µl boroszilikát üveg kapillárisok GC150TF-10 Petri-csésze poli-L-lizinnel bevont (Ø 35 mm) Eppendorf AG, Hamburg, Németország Clark Electromedical Instruments, Pangbourne, Reading, UK Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Németország 1.3 Vegyszerek és oldatok 1.3.1 Vegyszerek nátrium-pentánszulfonát vízoldható koleszterin HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA Biochrom AG, Berlin, Németország

II. Anyag és módszerek 28 1.3.2 Oldatok Pipettázzon oldatokat (sejten belüli oldatok) (mmol/l-ben) Anyag Standard oldat Oldat 6 mmol/l kloriddal KCl 140 6 Nátrium-pentánszulfonát 0 134 MgCl 2 6H 2 0 2 2 EGTA 11 11 CaCl 2 0, 1 0,1 Hepes 10 10 KOH 7,2 glükóz ph érték beállításához a 315-320 mosmol/l fürdőoldatok (sejten kívüli oldatok) (mmol/l) standard standard oldat oldatok (HBSS oldat) ozmolaritásának beállításához 0,1 mmol/l, 0,5 mmol/l, 1,0 mmol/l, 1,5 mmol/l koleszterin 0 koleszterin CaCl 2 1,25 1,25 glükóz 5,55 5,55 KCl 5,4 5, 4 KH 2 PO 4 0,35 0,35 MgSO 4 7H 2 O 0,81 0,81 NaCl 137 137 Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,34 0,34 Hepes 5 5 NaOH a pH érték beállításához 7,2-7,4 glükóz a 300-310 mosmol/l ozmolaritásának beállításához

II. Anyag és módszerek 13. ábra: A patch-clamp technika mérési konfigurációi és előállításuk (a Numberger 1996-ból módosítva) 1. Cellához kapcsolt konfiguráció: A cellához kapcsolt konfiguráció megfelel az összes többi konfiguráció kiinduló helyzetének. Ebben a konfigurációban nem lehet beavatkozni a sejt intracelluláris környezetébe. A sejtet olyan állapotban mérjük, amelyben az összes fehérje, beleértve az ioncsatornákat is, természetes környezetében, a membrán intracelluláris oldalán található. Csak a pipetta alatti területet, a tapaszt szabályozza az erősítő extracelluláris potenciálja.

II Anyag és módszerek 34 mozgatható mikroszkópasztalt szereltek fel. A megnagyított képet digitális videokamerával (Moticam 2000, Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Németország) rögzítették, és digitálisan egy számítógépen tárolták. Hidraulikus mikromanipulátort (Model XR-6, Narishige Scientific Instrument Lab., Tokió, Japán) használtunk a tapasz pipetta elhelyezésére. A tapasz pipettán belüli fürdőelektródát egy előerősítőhöz (CV-201A állomás, Axon Instruments Inc., Foster City, Kalifornia, USA) csatlakoztattuk. 14. ábra: A: A tapaszbilincs-mérőállomás felépítése B: A mikroszkópasztal megnagyobbítása Petri-csészével és tapasz pipettával (Scheel 2002-ből módosítva) (Scheel 2002) A sejtek leszívásához szükséges negatív nyomást a pipettatartóhoz csatlakoztatott perfúziós fecskendő hozta létre. Az előerősítőt erősítőhöz (Axopatch 200A, Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA) csatlakoztatták,

37 II Anyag és módszerek 2.2.6 Az elektróda ellenállásának mérése és az eltolás korrekciója A pipettát megtöltöttük és befogtuk a pipetta tartóba úgy, hogy a pipetta hegyét a fürdőoldatba merítettük. Enyhe túlnyomás megakadályozta a pipetta eldugulását a beszívott részecskék által. A pclamp 8 program negatív tesztimpulzust generált 5 mV feszültséggel, 5 ms alatt. A kapott áramválasz alapján a program Ohm törvénye alapján kiszámította az elektróda ellenállását. Ez az ellenállás 3 MΩ és 6 MΩ között volt a tesztekben (15. A. ábra). 15. ábra: A tapaszpipetta által kiváltott ellenállás és a tesztimpulzusra adott válaszváltozás a tapaszbilincs készülék konfigurációjának függvényében (módosítva: Numberger 1996)

II Anyag és módszerek 38 Azokat a feszültségeket, amelyek nem a cellából vagy a tesztimpulzusból származnak, offszetpotenciáloknak nevezzük (Numberger 1996). Ezek a potenciálok, amelyeket az ezüst/ezüst-klorid elektródák polarizációja, valamint a fürdő és a pipetta különböző elektrolit-koncentrációi közötti átmeneti potenciál vált ki, meghamisíthatják a mérési eredményeket. Ezeket a potenciálokat minden egyes mérés előtt a patch bilincserősítő segítségével kompenzálni kell, és nem haladhatja meg a 10 mV-ot (Numberger 1996). 2.2.7 Teljes sejt-patch-szorító és stimuláció A megfelelő vitális sejteket mikroszkóp alatt, kis nagyítással választottuk ki. A sejtek értékelésére Zajic és Schacht (Zajic és mtsai 1987) vitalitási kritériumait használták. A sejtek merev kinézetű sztereovillusokat, a bazális póluson elhelyezkedő sejtmagot, a citoplazmatikus részecskék enyhe, véletlenszerű mozgását és következetesen ép sejtmembránt mutattak (16. ábra). 16. ábra: Elszigetelt külső szőrsejt a hordozó szövet maradványaival és a tapasz pipettájával