A mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik a kísérleti krónikus folyamat során

Mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik a kísérleti krónikus hasnyálmirigy-gyulladás során.

folyamat

Mátrix metalloproteinázok és inhibitoraik a kísérleti krónikus hasnyálmirigy-gyulladás során. urn: nbn: de: gbv: 28-diss2010-0068-5

5 tézisek 48 6 rövidítések listája 51 7 irodalom 52 8 elismerés 66 9 függetlenségi nyilatkozat 67 3

1. ábra: Sejtfunkciók proteolitikusan aktív MMP-k hatására. (A) Az ECM lebomlása és a sejtvándorlás. (B) proliferáció vagy apoptózis indukciója. (C) A mediátorok és receptoraik modulálása. (D) További proteázok aktiválása proenzimjeik vagy inhibitoraik lehasításával (Vu és Werb, 2000). 3 A mátrix metalloproteinázok több mint 20 ismert cinkfüggő proteáz csoportja. Ezek képesek lebontani az extracelluláris mátrix lényeges összetevőit, például a kollagént, a laminint, a fibronektint vagy az elasztint. Különböző doménekből álló struktúrájuk miatt az MMP-ket négy csoportra lehet felosztani: matrilizin, hemopexin-szerű doménekkel rendelkező MMP-k, transzmembrán doménekkel rendelkező MMP-k, fibronektin-szerű doménekkel rendelkező MMP-k. Valamennyi MMP rendelkezik a szekrécióhoz szükséges régióval, látens állapotban van és katalitikus régióval rendelkezik, amely az aktív cinkkötő helyet tartalmazza. 53 Az MMP-k osztályozása azonban családokra osztáson alapul, amelyek összefoglalják az MMP-k szubsztrátjait (1. táblázat). 52 13

Ez vonatkozik a proenzimekre is. A specifik átfedését a TIMP-1 és a TIMP-2 50% -os szekvenciahomológiája magyarázza. A kapott MMP aktivitás a szövetben lévő MMP és TIMP arányától függ. Ennek az egyensúlynak a változásai vagy az MMP szignifikánsan megnövekedett proteolízis aktivitásához vezetnek, vagy a fibrogenezishez. 60 Név TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 Funkció Gátolja a Pro-MMP-9 és más aktív MMP-ket Gátolja a Pro-MMP-2 és az aktív MMP-2-et Nincs meghatározva Nincs meghatározva Nincs meghatározva 2. táblázat: Mátrix metalloproteinázok szöveti inhibitorai ( TIMP-k) és funkcióik 2. ábra: A mátrix metalloproteinázok katepszinnel és plazminnal történő aktiválásának kaszkádja. A Pro MMP-k automatikus aktiválása aktív MMP-kkel és MT MMP-vel 1. A mátrix lebontásának gátlása TIMP-ek által. (Evans et al. 1999) 61 15

TIMP 2 amplikon hossza: 453 bp TIMP 2 antiszensz CAA CAG GCG TTT TGC AAT GCA GA hossza: 23 bp CCC ATT GAT GCT CTT CTC TGT GA hossza 23 bp pqr2 és pqr3 vektor Graham M.A. Wells, Neures Limited, Egyesült Királyság. 2.1.3 Pufferek és oldatok Comassie Blue oldat DBTC DEPC-H 2 O oldat 1 rész jégecet (50 ml) 3 rész izopropanol (150 ml) 6 rész H2O (300 ml) 0,25 g Comassie Blue-t adunk 100 ml-re (1,25 g). Oldjuk fel a DBTC-t 96% -os etanollal két részben. Ezután keverje össze három rész glicerinnel. Inkubálja 1 liter dh20-t 1% DEPC-vel egy éjszakán át. Ezután deaktiválja a DEPC-t autoklávozással. Eozin 2,5 g eozin (színindexszám: 45380) 500 ml H 2 O HBSS + FCS Mayers Hematoxylin PBS (foszfátpuffer sóoldat) poliakrilamid elektroforézis puffer 50 ml HBSS és 15 ml FCS 4%, helyezzük jégre. Az alábbiakat feloldjuk 750 ml vízben: 50 g alumínium-szulfát (KAl (SO 4) 2 12H 2 O) 1 g hematoxilin (szín index 75290) 0,1 g nátrium-jodit (NaIO 3) 1,0 g citromsav 50 g klórhidrát Ad H 2 O 1000 ml 120 mM NaCl-ig 170 mm NaH 2 PO 4 3 mm KCl 26 mm KH 2 PO 4, ph 7,2 3,03 g (0,025 M) Tris 14,1 g (0,152 M) glicin 1,0 g (0,1%) SDS 1000 ml vízzel megtöltött. P1 puffer, Qiagen 50 mM Tris ph 8,0 10 mM EDTA Rnase A (400 μg/ml) P2 puffer, Qiagen 200 mM NaOH 1% SDS P3 puffer, Qiagen 2,55 M KAc ph 4,8 puffer QBT, Qiagen 750 mM NaCl 50 mM MOPS 15% etanol ph 7,0 19

QC puffer, Qiagen puffer QF, Qiagen Stop oldat szubsztrátum puffer TAE puffer 1 L 1 M NaCl 50 mM MOPS 15% etanol Ph 7,0 1,25 M NaCl 50 mM MOPS 15% etanol ph 8,2 25 mg Narancs G 2,5 g Ficoll 400 EDTA 0,5 M 50 mmol/l Tris ph8 + 5 mmol/l CaCl2 242 g Tris 57 ml ecetsav 96% 100 ml EDTA 0,5 M ph8 - 1000 ml H20 kettős diszt. Tris-puffer Tris-HCl 1 M DEPC-H 2O-ban, pH 7,4 Triton-oldat 2,5% 10 ml Triton + 490 ml H2O 2.1.4 Baktériumtenyésztő táptalaj Az alkalmazott baktérium törzs a Gibco BRL (Eggenstein, Németország) Escherichia coli DH5 törzse . A baktériumok szaporításához szükséges táptalajt a Difco Laboratories-től (Detroit, USA) szereztük be. Ampicillin LB agarlemezek Adjunk 100 mg/l ampicillint az LB agarlemezekhez. LB agarlemezek Luria Bertani (LB) - közepes 5 g élesztő kivonat 10 g triptikus pepton 10 g NaCl aqua dest. 15 g agar H 2O redisztál 1 l-re 5 g élesztő kivonat 10 g triptikus pepton 10 g NaCl aqua dest. A pH-t 7,4-re állítjuk, a H 2O-t újra redisztáljuk 1 N NaOH-val. 1 l transzformációs puffer 10% (tömeg/térfogat) polietilén-glikol 1500 30 mM MgCl 2 LB-tápközegben 2.1.5 készlet Qiagen Miniprep Qiagen Maxiprep QIAquick Spin RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Németország Qiagen, Hilden, Németország Qiagen, Hilden, Németország Qiagen, Hilden, Németország 20