A Mir-146a-5p gátolja a máj sztellátsejtjeinek aktiválódását és szaporodását

mir-146a-5p

  • Témák
  • Absztrakt
  • bevezetés
  • Eredmények
  • A máj miRNS-ek differenciális expressziója fibrózisos steatohepatitisben szenvedő egerekben
  • Gén ontológiai elemzés és microarray-alapú útelemzés differenciálisan expresszált miRNS-ekhez
  • A miRNS expressziójának validálása kvantitatív valós idejű PCR-rel (qRT-PCR)
  • Az miR-146a-5p szabályozását csökkentették ban,-ben HSC engedélyezve in vitro
  • A miR-146a-5p túlzott expressziója gátolta a HSC-k szaporodását
  • A miR-146a-4p hatása a HSC aktiválására és a kollagén lerakódására
  • Az miR-146a-5p közvetlenül hat a Wnt1 és Wnt5a mRNS 3'UTR-jére
  • miR-146a-5p Wnt1 és Wnt5a a transzkripció utáni szinten csökkent
  • A miR-146a-5p túlzott expressziójának és gátlásának hatása a célgénekre a Wnt jelátviteli útvonal után
  • A Wnt1 vagy Wnt5a leütés gátolta a downstream Wnt szignalizáció és fibrogenezis gén expresszióját
  • Vita
  • A módszerek
  • Alkoholmentes szálas steatohepatitis állatmodelljei
  • Szövettani és biokémiai elemzés
  • Microarray Microarray Assay
  • QRT-PCR elemzés
  • A miRNS gén lehetséges célpontjainak azonosítása
  • A HSC-k izolálása, tenyésztése és azonosítása
  • miR-146a-5p transzfekció HSC-kben
  • RNS interferencia és transzfekció
  • Immunocitokémiai elemzés
  • Sejtproliferációs teszt
  • Western blot elemzés
  • Luciferáz aktivitás vizsgálata
  • statisztikai elemzések
  • További információ
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

Témák

  • Májfibrózis
  • Alkoholmentes zsírmájbetegség

Absztrakt

bevezetés

Az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) a zsíros alkoholmentes zsírmáj betegség (NAFLD) spektrumának része, amelyet steatosis, lobularis gyulladás és progresszív pericelluláris fibrózis jellemez 1. Hosszan tartó májkárosodás esetén a steatohepatitis májfibrózissá válhat, amely az extracelluláris mátrix (ECM) túlzott felhalmozódásával jár. A májstellátum sejtek (HSC) központi szerepet játszanak a májfibrózis 2 patogenezisében. A nyugalmi HSC-k aktiválhatók krónikus steatohepatitis 3-ra reagálva. Az aktivált HSC-k stimulálják a kollagéntermelést és az ECM felhalmozódását, ami a májfibrózis kialakulásához vezet 4. Az alkoholmentes fibrózus steatohepatitis patofiziológiájának megértésében elért alapvető eredmények ellenére a fibrogenezis mechanizmusai steatohepatitis jelenlétében továbbra is megfoghatatlanok.

Eredmények

A máj miRNS-ek differenciális expressziója fibrózisos steatohepatitisben szenvedő egerekben

Amint az 1. ábrán látható, az MCD diétával táplált egerek májszakaszai rendezetlen lebenyszerkezetet, makrosteatózist mutattak ki a 3. zónában, lokalizált vagy fokális hepatocitikus nekrózist, gyulladásos beszivárgást és perisinusoidoid fibrózist (1A. Ábra). szérum. és AST szintek (P 2-szer) (1C. ábra).

( NÁL NÉL ) Az MCD-táplálékkal táplált egerek májszelvényeinek hisztopatológiai változásai, a festett hematoxilin- és eozin-kontroll (felül) és Masson-féle trichromatizmus (alul). ( ) Az MCD diéta hatása a szérum ALT és AST szintre. ( VS ) Különbözően szabályozott miRNS-ek, amelyeket a miRNS microarray azonosított. ( D ) A DNS mikrorajz adatainak validálása valós idejű RT-PCR alkalmazásával. Minden RNS-mintán három párhuzamos elemzést végeztünk, és az egyes miRNS-ek relatív mennyiségét U6 snRNS-re normalizáltuk. Az értékek átlag ± SD, ** P

( NÁL NÉL ) GO kategória elemzés, az összes differenciálisan szabályozott miRNS előre jelzett célpontjain alapulva. A függőleges tengely a GO kategóriát, a vízszintes tengely pedig a GO gazdagodását jelenti. ( ) Útelemzés differenciálisan szabályozott miRNS-ekhez. Minden egérből csak P6 CSH-sávokat gyűjtöttünk be. A frissen izolált élő HSC-k tisztaságát a tripánkék kizárási módszerrel 95% -nál nagyobbnak határoztuk meg. Az α-SMA, a HSC aktiváció markerének immunfluoreszcens festése szignifikáns növekedést mutatott az elsődlegesen aktivált HSC-kben in vitro (3A. Ábra). Kimutatták, hogy az aktivált HSC-kben a miR-146a-5p expressziója erősen lefelé szabályozott (3B. Ábra).

( NÁL NÉL ) Reprezentatív morfológiai képek és aktivált és nyugalmi HSC-k immunocitokémiai festése a desmin és az α-SMA esetében (400 ×). A ( ) miR-146a-5p-t valós idejű qRT-PCR-rel vizsgáltuk. Az értékek átlag ± SD, ** P # P

( NÁL NÉL ) Az LX-2 és HSC-T6 sejtproliferációt jelző Desmin festés csökken, ha a miR-146a-5p túlzottan expresszálódik. A ( ) miR-146a-5p gátolta az LX-2 és HSC-T6 sejtek növekedését, a CCK-8 vizsgálatokkal meghatározva. Az értékek átlag ± SD, * P

( NÁL NÉL, VS ) potenciális miR-146a-5p kötőhelyek a Wnt1 és Wnt5a 3'UTR-jén. ( , D ) A HEK-293T sejteket egy luciferáz riporter vektorral transzfektáltuk, amely a Wnt1 és Wnt5a 3'UTR vad típusú vagy mutáns formáját tartalmazta, miR-146a-5p utánzások jelenlétében, utánozva a miR-146a sejteket. -5p inhibitor és gátló kontroll, majd a transzfekció után 48 órával értékeljük a luciferáz riporter aktivitását. Az értékek átlag ± szórás, * P # P # P ## P

( NÁL NÉL ) mRNS és fehérje szintek ( ) β-katenin, GSK-3β és NFAT5 MCD-vel táplált egerekben és kontrollokban. ( VS ) A HSC-T6-ot miR-146a-5p inhibitorral vagy inhibitor kontrollal, miR-146a-5p utánzókkal vagy utánzó kontrollal transzfektáltuk 48 órán át. Az mRNS és a fehérjék szintje ( D ) A β-katenint, a GSK-3β-t és az NFAT5-et valós idejű RT-PCR-rel és Western-blot-analízissel analizáltuk. A Β-aktint használtuk terhelés kontrollként. Az értékek átlag ± SD, ** P

Összegzésként megállapítottuk a máj miRNS-eket, és értékeltük azok expressziós profilját az MCD-diéta által kiváltott alkoholmentes fibrózus steatohepatitisben a mikrochip segítségével. A validált miRNS-ek közül a miR-146a-5p alkoholtartalmú fibrosizáló steatohepatitisben és aktivált HSC-kben erősen csökkent. A miR-146a-5p túlzott expressziója hozzájárult a májfibrózis kialakulásához azáltal, hogy gátolta a proliferációt, aktiválta a HSC-ket és kollagént rakott le, elnyomva a Wnt jelátviteli utat. Ezért a miR-146a-5p új szabályozóként szolgálhat az alkoholmentes fibrózus steatohepatitis patogenezisében.