A MyoD interaktóm azonosítása a tömegspektrometriával összekapcsolt tandem affinitás tisztítással

Absztrakt

Bevezetés

A MyoD-t azért tekintik a főszereplőnek a terminális izomdifferenciáció 9 kiváltásában, mert képes teljes mértékben differenciált, nem izomrendszerekben 10-13 myogén meghatározási/differenciálódási (transz-differenciálódási) programot kiváltani. A MyoD erőltetett expressziója valóban indukálja a különböző sejttípusok transz-differenciálódását, még azok is, amelyek más embriológiai eredetűek. 12. Például a MyoD képes átalakítani a hepatocitákat, fibroblasztokat, melanocitákat, neuroblasztokat és adipocitákat hasonló izomsejtekké. A MyoD transzdifferenciációs hatása a myogén genetikai program (különösen a célgének) rendellenes aktiválódását jelenti nem izmos környezetben, egyidejűleg az eredeti genetikai program (különösen a proliferációs gének) elhallgattatásával.

A myoblast proliferációban a MyoD expresszálódik, de nem képes aktiválni a célgénjeit, még akkor sem, ha a 14-16. Ezért továbbra is megfoghatatlan a MyoD azon követelménye, hogy folyamatosan differenciálatlan myoblastokban fejeződjön ki. A MyoD képes volt elnyomni a célgéneket a represszív kromatint módosító enzimek toborzása miatt a myoblast proliferációban a betöltés előtt, hogy aktiválják a 14, 17 kromatin átalakító enzimeket. Például a myoblast proliferációban a MyoD társul a KAP-1 transzkripciós ko-represszorral, a hiszton-deacetilázokkal (HDAC) és a lizint elnyomó metil-transzferázokkal (Kmts), beleértve a H3-hiszin-9-lizint vagy a H3K9-et és a H3K27-Kmts-t, és aktívan elnyomja a géneket lokálisan represszív kromatinszerkezet létrehozásával 14, 17. Fontos, hogy egy nemrégiben készült jelentés azt mutatta, hogy magát a MyoD-t közvetlenül a H3K9 KMT G9a metilezi, ami gátolja annak transzaktivációs aktivitását 16.

A nem izomsejtek MyoD általi transz-differenciálásában szerepet játszó epigenetikai mechanizmusok jórészt ismeretlenek. Különösen bizonyos sejtvonalak rezisztensek az indukált MyoD-transz-differenciálódással szemben. Tehát a HeLa sejtekben a MyoD inaktív, vagy akár represszorként, mint transzkripció aktivátorként funkcionálhat, mivel az SWI/SNF 18 komplex kromatin átalakítás BAF60C alegységének expressziója hiányzik. A génrepresszió mechanizmusainak jobb jellemzése érdekében a MyoD indukálta. Alkalmas a MyoD azon képességének tesztelésére is, hogy társult partnereivel indukálja a céllókuszokban a represszív kromatin környezetet, és ezért felfedezze a MyoD-függő represszív mechanizmusokat a myoblast proliferációban a terminális differenciálódás finomítása érdekében.

Itt írjuk le a MyoD partnerek azonosításának protokollját Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) segítségével, tömegspektrometriás (MS) jellemzéssel párosítva. Az S3 Flag-HA MyoD-t stabilan expresszáló HeLa-sejtek elegendő anyagot szolgáltattak a MyoD-komplexek frakcionált magkivonatokból történő megtisztításához. A MyoD partnerek azonosítását a heterológ rendszerben validálás követte egy releváns rendszerben.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Sóval extrahálható és kromatinnal kötött nukleáris HeLa-S3 frakciók elkészítése

2. Fehérjetisztító komplexek

Megjegyzés: Minden sejtvonalból párhuzamosan végezzen kivonatokat (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD és kontroll, Hela-S3 Flag-HA).

3. Tömegspektrometriás elemzés

Megjegyzés: A következő lépéseket kell megvitatni a telepítéssel nak,-nek spektrometria nak,-nek tömeg, amely elvégzi az elemzést.

  1. 3/4 (22,5 µl) mintát egészítsen ki 7,5 µl 4x töltőpufferrel és 3,3 µl 10x redukálószerrel, és forralja 5 percig 96 ° C-on.
  2. Töltse a mintákat SDS-poliakrilamid 4-12% gélre. gél 150 V állandón futtatjuk 5 percig, hogy az összes fehérje szétválás nélkül bejusson a gélbe.
  3. Mossa le a gélt vízzel; fixáljuk 20-30 percig fixáló oldattal (10% ecetsav, 50% metanol, 40% ultratiszta víz), majd ötször mossuk a rögzített gélt ultratiszta vízben.
  4. Vágja le a fehérjéket tartalmazó csíkokat, tárolja 1 ml vízben egy 1,5 ml-es csőben, és küldje el a tömegspektrometriás létesítménybe.

Elemzés 4. Adatok

Megjegyzés: Ez az elemzés általános útmutatása. A pontos lépések függenek az MS telepítés által biztosított adatok adott módjátólaz elemzés elvégzéséhez használt (például 21,22).

  1. Hasonlítsa össze a "MyoD" eluátumokban azonosított fehérjék listáját a megfelelő negatív kontroll készítményből kapott listával. Zárja ki az elemzésből a mindkét listában található fehérjét.
  2. Távolítsa el azokat a fehérjéket, amelyek összesített peptidszáma ≤2, a fennmaradó listából.
  3. A DAVID Bioinformatikai erőforrások (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) segítségével hozzáférhet a kapott fehérjefüggvény funkcionális megjegyzéséhez és funkcionális osztályozásához, és osztályozza a fehérjék listáját 23,24.
  4. (Opcionális) Távolítsuk el a listáról a "stopposokat", a nem nukleáris fehérjéket, amelyek erős negatív töltésű DNS-kötő adventitia 25-ével rendelkeznek. Ezek citoszkeletális, citoplazmatikus, mitokondriális, membrán és receptor fehérjéket tartalmaznak ( 1. táblázat és 2).
  5. Hasonlítsa össze az SE és NE frakciók MyoD interaktorainak eredményeit, hogy azonosítsa az egyes frakciókra jellemző közös fehérjéket és fehérjéket (2. ábra).

5. A Western Blot által azonosított interaktorok megerősítése

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A MyoD aktivitás szabályozásának megértése érdekében vállaltuk a MyoD komplexek kimerítő jellemzését biokémiai tisztítás alkalmazásával, a MyoD kettős tagjelű formájának immuntisztításával, majd tömegspektrometriával (MS). A HeLa-S3-expresszáló Flag-HA-jelölt MyoD sejtvonal és a Flag-HA-t expresszáló kontroll sejtvonal lehetővé tette, hogy elegendő anyagot nyerjen a MyoD-komplex tisztításához a Flag-HA -MyoD kettős affinitású tisztításával.

A sejtkivonatokat frakcionálják citoplazmatikus és magfrakciókká, majd tovább frakcionálják az extrahált só magfrakcióját (magkivonható só, SE), és nukleoszómákban dúsítják (NE nukleoszóma, frakciókban dúsítva). TAP-Tag tisztítás ezekből az elválasztott magfrakciókból (1. ábra, 1. táblázat és 2) megengedett azoknak a partnereknek a szétválasztása, akiknek viszonylag alacsony a bőségük, ha egy adott szubnukleáris térbe lokalizálódnak. Ezenkívül egy ilyen stratégiát alkalmaztak a nem kötött (SE) és a DNS-hez kötött (NE) MyoD partnerek felderítésére, hogy betekintést nyerjenek a MyoD aktivitás szabályozásába.