A Smac mimetikumok nekrotikus gyulladást és tumorsejtek pusztulását idézik elő a
alanyok
absztrakt
A makrofágok plasztikus sejtek, amelyeket különböző aktivációs állapotok jellemeznek. 23 A klasszikusan aktivált makrofágok (M1) és az alternatív módon aktivált makrofágok (M2) képviselik a két szélsőséget a makrofág fenotípus spektrumában A tumorral társult makrofágok citokin expressziós profiljuk alapján M2 makrofágokba vannak besorolva; 24 Magas szintű immunszuppresszív citokineket, például interleukin-10-et (IL-10) termelnek, és többnyire szilárd daganatokban a szövetek helyreállítási funkcióival rendelkeznek a fibroblasztokkal. 23, 25 Ezzel szemben az M1 makrofágok nagy mennyiségű pro-gyulladásos citokint termelnek, ideértve az interferont-y-t is. (IFN & g;) és IL-12, és részt vehetnek a hatékony tumorellenes immunválasz kiváltásában. A makrofágok plaszticitása új terápiás megközelítéseket javasolt az M2 26. fenotípus megfordítására, különösen olyan daganatokban, amelyekben a makrofágok, például a petefészek karcinóma beszivárgása alapvető szerepet játszik. Ennek megfelelően egy egér petefészek ascites modellben makrofágokat állítottunk elő az NF- & kgr; A B-jelzés átprogramozott. 27.
Nemrégiben ismertettük az XIAP-t, a cIAP1-et és a cIAP2-t célzó új dimer molekulák szintézisét. 28, 29 Ezen molekulák egyike, az SM83, gátolta az SM-érzékeny MDA-MB231 humán emlő adenokarcinóma és a rabdomyosarcoma Kym-1 növekedését, más sejtvonalakat azonban nem. Itt két rákos ascites egér xenograft modellt használunk annak bemutatására, hogy az SM83 monoterápiában alkalmazva növeli ezeknek az egereknek a túlélését azáltal, hogy tumorral társult makrofágokat céloz meg. TNF által az SM83 gyorsan kiváltja az intraperitoneálisan (ip) injektált rákos sejtek nekrózisát, amelyek egyébként in vitro teljesen ellenállnak az SM83 daganatellenes hatásainak. Munkánk azt mutatja, hogy az SM83 in vitro és in vivo különböző hatásmechanizmusokkal rendelkezik, és daganatellenes aktivitását in vivo fejti ki az immunrendszer stimulálásával.
Eredmények
Az SM83 érzékenyíti az IGROV-1 petefészek karcinóma sejtvonalat a TRAIL apoptotikus hatásaira
Az SM83 in vitro apoptózist indukál, ha TRAIL-rel kombinálják. ( a ) A dimer SM SM83 kémiai szerkezete. ( ) Az IGROV-1 sejteknek 0, 1 vagy 1, 0 µl-t adtunk M SM83 önmagában vagy 2 vagy 10 ng/ml TRAIL kombinációval kezelve. A sejtnövekedést százalékban fejezzük ki a vivőanyaggal kezelt sejtekhez viszonyítva. Az értékek egy kísérlet átlagának és SD-jének felelnek meg, amely három elvégzett kísérlet reprezentatív kísérlete. ( c és d ) Az XIAP, cIAP1, cIAP2 és a hasított PARP (Cl PARP) Western blot-analízise az IGROV-1 sejtekben, amelyeket SM83-mal kezeltünk ( c ) vagy SM59 (SM-164) ( d ) 10 ng/ml TRAIL hiányában vagy jelenlétében kezelik. Az aktin töltésszabályozásként jelenik meg. Nyíl, specifikus XIAP szalag
A monoterápiás SM-ek növelik a rákos ascites egerek túlélését
Az SM83 és az SM59 vizsgálatát in vivo egér xenograft modell alkalmazásával végeztük, amelyben IGROV-1 sejteket ip-ba injektáltunk atmikus meztelen egerekbe, ami asciteset és halált eredményezett. Az SM83 (2a) és az SM59 (2b) kezelés egyaránt növelte az egér túlélését (P.
Az SM83-mal végzett kezelés monoterápiában növeli a rákos ascites egerek túlélését. ( a ) A meztelen egereket ip-ben IGROV-1 sejtekkel injektálták, és kezeletlenül hagyták őket (O), vagy az injekció beadását követő naptól számított 2 egymást követő héten át hetente ötször 5 mg/kg SM83 (l), 2,5 mg/kg TRAIL ( ∇) vagy ugyanazon SM83 és TRAIL dózissal együtt (▪). Kettőt bemutató kísérlet látható. Minden kezelési csoport hét egeret tartalmazott. Túlélési görbe SM83 kezelt egereknél és kontrolloknál. ( ) Túlélési görbe SM59-kezelt és kontroll egereknél. Kezeletlen (○) vagy SM SM59 (∇). ( c Az ascites kialakulását a testtömeg ellenőrzésével ellenőriztük a 17. napon. ( d és e ) Meth A sejteket injektáltunk BALB/c egerekbe, és a 7. naptól kezdve naponta 5 mg/kg SM83-mal kezeltük. ( d Az ascites kialakulását a testsúly monitorozásával ellenőriztük a 13. napon. A vízszintes vonal az átlagot jelenti. ( e ) Túlélési görbe kezeletlen () vagy SM83 kezelt egereknél () a 7. naptól
Annak tesztelésére, hogy az SM83 in vivo aktivitása sejtvonal-specifikus volt-e vagy csak immunhiányos egerekre korlátozódott-e, egy másik ascites modellt használtunk, amelyben egér Meth A szarkóma sejteket injektáltunk ip-ben immunokompetens szingenikus BALB/c egerekbe. Az IGROV-1 sejtekhez hasonlóan a Meth A sejtek növekedését sem gátolta az SM83 in vitro (az adatokat nem mutatjuk be). Egerekben az SM83 csökkentette az ascites progresszióját, amelyet kisebb testtömeg-növekedésnek tekintettek (2d), és megnövelte az átlagos túlélési időt a kezeletlen állatok 15 napjáról 26 napra (P = 0,0721; 2e). Ebben a modellben sem volt előnyös a TRAIL kombinációja (az adatokat nem mutatjuk be). Amikor az SM83-mal meggyógyított egereknek (14 tesztelt egérből 4-et) új injekciót kaptak 4 × 10 5 Meth A sejtből (kétszer annyi, mint az első adagolás), nem volt új ascites (az adatok nem Látható). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy ezeknél az állatoknál adaptív immunitás alakult ki.
Az SM83 nem apoptotikus mechanizmus révén gyorsan megöli az ascitesben úszó rákos sejteket
Az SM83 aktivitás mechanizmusának in vivo tanulmányozásához ascites folyadékot gyűjtöttünk az egerekből, amelyeket IGROV-1 sejtekkel injektáltunk, és SM83-mal kezeltünk 3, 6 vagy 24 órán át, és megszámláltuk a tumorsejteket. Az eredmények figyelemre méltó csökkenést mutattak (P.
Az ascites lebegő daganatsejtek számának csökkenéséért felelős sejthalál mechanizmusának megértése érdekében megvizsgáltuk az apoptózis mediátorok expresszióját ezekben a sejtekben különböző időpontokban. 24 óra elteltével az SM83 kezelés csak csekély növekedést eredményezett a hasított PARP-ben, nem volt bizonyíték a hasított, aktív kaszpáz-8-ra (ami várható volt, mert ezeket a sejteket az SM monoterápia elpusztítja in vivo), és csak csekély hatás a kaszpáz -3 hasításán (3d. ábra). Ezzel szemben a TRAIL-lel kezelt sejtek nagyobb mértékben aktiválták ezeket az apoptotikus markereket, bár a TRAIL hatástalan volt az ascites sejtszám csökkentésében (S1. Kiegészítő ábra). Az apoptotikus események kimutatására irányuló kísérlet során Western blot-ot hajtottunk végre a 3 és 6 órás kezelés után összegyűjtött sejteken (3e). Ebben az esetben is az SM83 okozta a cIAP1 és a cIAP2 teljes lebomlását, de a PARP, a kaszpáz-8 és a kaszpáz-3 hasított formái csak gyengén halmozódtak fel. Az apoptotikus kaszkád ezen alacsony aktivitása azt jelezte, hogy az ascites tumorsejtek halálának oka elsősorban nem apoptotikus volt.
Annak felmérésére, hogy az autofágia - egy másik mechanizmus, amely abnormálisan és folyamatosan aktiválódva sejthalálhoz vezethet - felelős az ascites tumorsejtek elvesztéséért, megmértük a Beclin-1 és a hasított LC3B szintjét. Az SM83-mal végzett kezelés nem növelte ezeknek a fehérjéknek a szintjét (S2. Kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy az autofágia nem vesz részt az SM83-indukálta tumorsejtek pusztulásában.
Az SM83 gyulladásos eseményt vált ki in vivo
Az SM83 kezelés in vivo indukálja a gyulladásos citokinek expresszióját. A meztelen egereknek ip-ben IGROV-1 sejteket injektáltunk, és egyszeri 5 mg/kg SM83 dózissal kezeltük; Az asciteset az SM83 beadása után 3, 6 és 24 órával gyűjtöttük össze. ( a ) Az SM83 ideiglenesen megemelte az ELISA-val mért egér TNF-szintet. ( ) Az SM83-kezelés csökkentette az ascites sejtek számát, de ez a hatás blokkolt volt, amikor a TNF-et nagyobb dózisú etanerceptel szekvestálták (P = 0,0118, összehasonlítva az egyedüli SM83-kezeléssel). ( c ) Az ascites tumorsejtfehérje Western-blotjai kezeletlen egerekből és egerekből, amelyeket SM83-mal kezeltek önmagukban vagy 150 mg/kg etanercept kombinációval. Nyíl, speciális szalag az XIAP számára. ( d - H ) ELISA eredmények IL-1-re? ( d ), IFN-? ( e ), IL-10 ( f ), átalakítja a növekedési faktort & bgr; (TGF-?) ( G ) és az IL-4 ( H ) a fentiek szerint kezelt egerek ascites folyadékában. Az IL-10 eredményei többszörös indukcióként jelennek meg a rekombináns fehérje standard hiánya miatt
Az SM83 elősegíti a makrofágok aktiválódását egy M1-szerű fenotípus felé
Az SM kezelés aktiválja a makrofágokat és érzékenyíti nekrotikus halálra. ( a és ) A BALB/c BMDM-et (5x105) 96 lyukú lemezekre oltottuk, hagytuk 16 órán át tapadni és 1 μl-vel injektáltuk 24 órán át. M SM83 kezelve vagy sem. Az SM83 kezelés elősegítette a proinflammatorikus citokinek, a TNF ( a ) és IL-1β ( ). ( c ) NF-? Az SM83 által végzett B-aktiváció az NF-a-val stabilan transzfektált RAW makrofág sejtvonalban értékelve. B-luciferáz riporter gén. Két végrehajtott reprezentatív kísérlet látható. Az értékek átlag és SD; n = 3. ( d és e ) A BALB/c BMDM-et hat lyukú lemezekre oltottuk, hagytuk 16 órán át tapadni, és nekrostatin-1, illetve z-vad-fmk hiányában vagy jelenlétében SM83 soros hígításokkal kezeltük a nekroptosis vagy az apoptózis gátlására. ( d) A sejt morfológiáját bemutató reprezentatív képek 24 órás kezelés után. ( e ) A sejtek életképessége a CellTiter-Glo teszttel végzett kezelések után
Annak kizárására, hogy az SM83 által indukált IL-1? A szekréció a lipopoliszacharidokkal (LPS) való szennyeződés miatt következett be, a BMDM-et TLR4 knockout (KO) egerekből készítettük, és megállapítottuk, hogy az IL-1? hasonló mértékben szekretálódott, mint a BALB/c sejtekből (S4 kiegészítő ábra). Ezenkívül azt találták, hogy az SM83 injekciós készítmények nem tartalmaznak kimutatható mennyiségű LPS-t az Endosafe PTS tesztben (Charles River Laboratories, Calco, Olaszország) (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az SM83 által indukált IL-1? -A termelés nem az LPS szennyeződés miatt következett be.
A neutrofil sejtek felhalmozódása ascitesben
Ezután a BALB/c (vad típusú) és a TNF-receptor 1-hiányos (TNF-R1) egerek lépéből neutrofileket izoláltunk, hogy megvizsgáljuk a neutrofilek szerepét az SM83 tumorellenes aktivitásában in vitro. A Transwell-vizsgálatokban a vad típusú neutrofilek vándorlása az ascitesbe SM83-mal kezelt egerekből nagyobb volt, mint a kezeletlen egerekből (6d). A HMGB-1 inhibitor részben csökkentette a migrációt, míg a TNF-R1-hiányos egerek neutrofiljei nem vándoroltak az SM83-mal kezelt egerek ascitesére reagálva. SM83-aktivált vad típusú neutrofilekkel kezelt egerek ascitái szuperoxidot termelnek még a TNF-blokkoló etanercept jelenlétében is, míg a glicirrizin teljesen blokkolta ezt az aktivitást (6e). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a neutrofil migrációt SM83-mal kezelt egerek ascitesének jelenlétében a TNF stimulálja, míg az aktiválást a HMGB-1 okozza. A TNF fontosságát a neutrofil migráció szempontjából in vivo is bizonyították, ahol az etanercept előkezelés blokkolta ezen sejtek toborzását az ascitesben (S5. Kiegészítő ábra).
Összefoglalva elmondhatjuk, hogy munkánk azt mutatja, hogy az SM83 in vivo hat a rák ascitesében azáltal, hogy a makrofágokat a daganatot támogató M2-szerű fenotípusból M1-szerű fenotípusba állítja át, amely tumorellenes aktivitással rendelkezik. Az M1 makrofágok citokineket szekretálnak, mint például TNF, IL-1a. és IFN? az ascites rákos sejtek gyors TNF-függő nekrotikus halálának okozása (7); A haldokló sejtek ezután felszabadítják a HMGB-1-et, amely a TNF-mel együtt stimulálja a neutrofilek masszív beszivárgását.
Az SM83 javasolt hatásmechanizmusa rákos ascitesben. Az SM83 serkenti a makrofágok megfordulását az M2-ről az M1-fenotípusra. Az M1 makrofágok által kiválasztott TNF kiváltja a rákos sejtek nekrotikus halálát az ascites folyadékban; A haldokló sejtek felszabadítják a HMGB-1-et, amely a TNF-mel együtt neutrofileket toboroz
vita
Ebben a tanulmányban leírjuk az újonnan szintetizált SM SM83 in vivo aktivitását két xenograft modellben rákos ascites esetén egerekben. Megmutattuk, hogy az SM83 in vivo monoterápiában hatékony humán és egér rákos sejteken, amelyek in vitro rezisztensek az SM-re, és azt mutatják, hogy ezek a sejtek nem apoptotikus, TNF-függő mechanizmus révén pusztulnak el. Bizonyítékokat is szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy az SM83 tevékenységét gyulladás kiváltásával és az immunsejtek aktiválásával végzi, ami a rákos sejtek immunogén halálát eredményezi. Ezenkívül tanulmányunk azt mutatja, hogy az SM83 (és esetleg más SM-ek) aktivitása a komplex in vivo környezetben eltér az in vitro már megfigyeltaktól.
Daganat mikrokörnyezetben, beleértve a petefészekrákot is, a makrofágok M2-szerű fenotípust nyernek. 38, 39 Mindazonáltal egyes szerzők különböző stratégiákat javasoltak 23, 24, amelyek cserélhetik a makrofágok állapotát a hatékony tumorellenes válasz irányában. Ebben az összefüggésben megmutatták az M2 makrofágokat megzavaró szokásos terápiák hatékonyságának növelésének lehetőségét, különösen azokban a daganatokban, amelyek progressziója szigorúan támaszkodik támogatásukra, mint például a petefészekrák. Ezek a daganatok komplex kapcsolatot teremtenek az ascitesen belüli kapcsolódó immunsejtekkel, 41 és kialakítják a makrofágok által termelt immunszuppresszív mikrokörnyezetet. Ezért petefészekrák esetén a makrofágok repolarizációja vagy toborzásuk gátlása új hatékony terápiás stratégia lehet.
Eredményeink azt sugallják, hogy az SM-ek a makrofágok polarizációjával szabályozzák a rákos ascites elleni immunválaszt, és ezáltal terápiás potenciállal rendelkeznek. Valójában a Smac/DIABLO 42 és az itt bemutatott SMIM utánzó nekrotikus vagy nekrotikus sejtpusztulást vált ki. A nekrotikus sejtek, az apoptózis kivételével, felszabadítják a HMGB-1 43 alarmin egy nem oxidált, immunogén formáját, amely a fejlett glikációs végtermékek, a TLR4, TLR7 és TLR9 receptorok receptorainak aktiválásával aktiválja a dendritikus sejteket. 44 Ezenkívül a nekrotikus sejtek képesek kiképezni a CD4 + T-sejteket, amelyek elengedhetetlenek az adaptív immunválasz kialakulásához. 45 Az SM83 által kiváltott nekrózis által kiváltott adaptív immunválasz lehetőségét növelik eredményeink, ha BALB/c immunokompetens egereket alkalmazunk meth-A ascitesszel. Ezen egerek egy részét SM83-kezeléssel gyógyítottuk meg, és nem alakult ki további ascites, ha új dupla Meth A-sejtnek tették ki őket, ami arra utal, hogy immunisak a Meth A-szarkóma sejtekkel szemben.
Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy az SM83 aktív a monoterápiában, elősegítve a gyulladást és az immunogén sejthalált. Ezek a megfigyelések magyarázatot adnak arra, hogy az SM miért növeli a szokásos terápiák hatékonyságát az immunrendszer stimulálásával. Végül annak bizonyítása, hogy az SM gyulladásos reakciót válthat ki és aktiválja az immunrendszert, értelmezi, hogy az SM miért lehet hatékonyabb in vivo, mint in vitro, 11, 46, és mi eredményeink a rákos sejtek elpusztításában.