A tápanyagok szinergiájának hatása az emberi osteosarcoma sejtekre U-2 OS; Dr
M. Waheed Roomi, Vadim Ivanov, Matthias Rath és Aleksandra NiedzwieckiTudósító: Alexandra Niedzwiecki, Ph.D.
1260 Memorex Drive
Santa Clara, Kalifornia, 94050, USA
Telefon: 408-567-5564
Fax: 408-986-9403
E-mail: [email protected]
rövid változat
Bevezetés:
A csont vagy lágy szövetek elsődleges rosszindulatú daganatainak jelenlegi terápiája, amely csontképző mesenchymális sejtekből származik, rossz prognózissal rendelkezik, különösen annak a fokozott kockázata miatt, hogy a kemoterápia más karcinómákat fog kialakítani. Ezért új kezelési stratégiákra van szükség, amelyek toxikus mellékhatások nélkül hatékonyak. A laboratóriumunkban nemrégiben végzett in vitro vizsgálat kimutatta, hogy a Nutrient Synergy (NS), a lizin, prolin, arginin, aszkorbinsav és epigallokatechin-gallát egyedülálló összetétele kemoprevenciós hatással van a rák különböző típusaira. Az NS potenciális szinergikus rákellenes aktivitást mutatott azáltal, hogy gátolta a mátrix metalloproteinázokat, az enzimeket az invázióval és az áttétekkel szemben.
Célkitűzés:
Megvizsgáltuk a tápanyagok szinergiájának hatását az emberi osteosarcoma sejtekre U-2 Os a citotoxicitás, a mátrix metalloproteinázok (MMP): MMP-2 és MMP-9 kiigazításának és az invazív potenciál mérésével.
Módszerek és anyagok:
Humán osteosarcoma sejteket U-2 Os tenyésztettünk McCloy táptalajban, amelyet 10% -os marha magzati szérummal és 24 lyukú antibiotikus tenyésztő lemezekkel kezeltünk. Összefolyáskor a sejteket 0, 10, 50, 100, 500 és 1000 m g/ml tápanyag-szinergiára állítottuk be, mindegyik dózist három példányban. A citotoxicitást az MTT teszttel 24 óra elteltével mért sejtek száma, az MMP expressziója zselatináz zymográfiával a kontroll táptalajban és az invázió Matrigel alapján értékeltük.
Eredmények:
A tápanyagok szinergiája nem volt mérgező 10 mg/ml-nél, és a toxicitás jelenlegi dózis-válasza legfeljebb 60% -kal meghaladta az 1000 mg/ml kontrollszintet. A szimográfia az MMP-2 és az MMP-9 kimenetének dózisfüggő gátlását mutatta ki tápanyag-szinergián keresztül, gyakorlatilag teljes gátlással 500 mg/ml koncentrációban. Az osteosarcoma sejtek Matrigel általi inváziója jelentősen csökkent 50 mg/ml (74%) koncentráció mellett, és teljesen gátolt 100 mg/ml koncentrációban.
Következtetés:
Eredményeink azt mutatják, hogy a tápanyag-szinergia kiváló jelölt terápiás alkalmazásra az oszteoszarkóma kezelésében az MMP expresszió, az angogenezis és az invázió gátlása miatt - mindez fontos és ígéretes paraméter a rákszűréshez.
bevezetés
Az osteosarcoma, a csontokat vagy lágyrészeket érintő elsődleges rosszindulatú daganat, amely a csontokat képező mesenchymális sejtekből származik, általában a distalis combcsontban (combcsont), a proximális (a törzs felé vezető) sípcsontban (állcsont), a proximális humerusban (humerus) és a disztális sugár (beszélt). A klasszikus osteosarcoma agresszív gyors növekedést mutat, magas a helyi másodlagos áttétek és a korai tüdőmetasztázisok kockázata. Ez a leggyakoribb csontrák és a hatodik leggyakoribb gyermekkori rák, amely jellemzően növekedési rohamot átélő serdülőknél alakul ki. A fiúknál gyakoribb, mint a lányoknál. A legtöbb osteosarcoma a növekvő csontsejtek DNS nem öröklődő hibáiból származik. Mivel ezek a hibák véletlenszerűen és kiszámíthatatlanul fordulnak elő a csontnövekedés során, jelenleg nem lehet hatékonyan megelőzni ezt a típusú rákot (1).
Az osteosarcoma jelenlegi terápiái műtétből (amputáció vagy végtagmentő műtét) és kemoterápiából állnak. Ezek a terápiák rossz prognózissal járnak, különösen ennek a ráknak az erősen invazív jellege, valamint az áttétek és a kemoterápiából származó egyéb rákos megbetegedések megnövekedett kockázata miatt. Az Anderson Rákközpontban 31 olyan kísérleti páciensből, akinek diagnosztizálták a lokalizált osteosarcomát (2), és akiket hagyományos kemoterápiával (nagy dózisú metotrexát- és leukovarinmentő kezelés 3 betegnél és intraarteriális cisplatin 28 betegnél) kezeltek, csak 3 betegnél nem tapasztaltak helyi relapszust vagy Tüdőmetasztázisok a következő 225+ hónapos időszakban. A kemoterápia mellékhatásai közé tartozik a vérszegénység, a kóros vérzés, a csontvelő, a máj és a vesekárosodás pusztulása miatt megnövekedett fertőzésveszély, menstruációs rendellenességek, hólyaghurut és vér a vizeletben, bőr osteosarkoma és osteosarcoma, amely áttétet ad a tüdőben, az agyban vagy más csontokban (1).
A rákos sejtek testben történő elterjedésének és metasztázisának egyik legfontosabb mechanizmusa magában foglalja a kötőszövet enzimatikus megsemmisítését is. A folyamat terápiás kísérletei bizonyos gyógyszerekkel való korlátozására sikertelenek voltak, és jelenleg nincs más eszköz a rákos metasztázisok korlátozására. Évtizedek óta az oszteoszarkóma szokásos terápiája műtétből és kemoterápiából állt, amelyek a rákos sejtek elpusztítására irányulnak, de nem az áttéteket célozzák meg. A sugárzás és a kemoterápia nemcsak hatástalan a gyógyulás elérésében, hanem válogatás nélkül megtámadja az összes sejtet, sejtkárosodást okozva, tönkreteszi a kötőszövetet és ezáltal lehetővé teszi a rák áttétjeit. Nyilvánvalóan szükség van egy biztonságos és hatékony természetes eljárásra, amely korlátozhatja a rák áttétjének folyamatát.
A rákos sejtek minden típusa az extracelluláris mátrix (ECM) gyengülésével, különböző mátrix metalloproteinázok (MMP) segítségével formál daganatot. Ezeknek az enzimeknek a aktivitása együtt jár a tumor növekedésének agresszivitásával és a rák behatolásával. 1992-ben Rath és Pauling (3) megállapították, hogy a tápanyagok, mint például a lizinek és az aszkorbinsav, természetes gátlóként működhetnek az ECM protoanalízisében, és képesek befolyásolni a daganatok növekedését és tágulását. Ezek a tápanyagok különböző mechanizmusok révén gyakorolhatják daganatellenes hatásukat. Ezek közé tartozik az MMP-k gátlása és a rákos sejteket körülvevő kötőszövet megerősítése (daganat kapszulázó hatása). Egy korábbi vizsgálatunkban bemutattuk a lizin, az aszkorbinsav, a prolin és az epig a llocatechin-gallát (ECGC) antiproliferatív és anti-invazív potenciálját az emberi emlőrákon (MDA-MB 231), a vastagbél (vastagbél) rákos sejteken (HCT 115) és a melanoma sejttípusokon ( A2058) (4). A tápanyagok szinergiája ezen daganatok növekedését is elnyomta, káros hatás nélkül a meztelen egerekben. A jelenlegi tanulmányban a tápanyag-szinergia tumorellenes potenciálját vizsgáltuk in vitro humán osteosarcoma U-2 OS típusú OS.
Célmeghatározás
Megvizsgáltuk a tápanyag-szinergia (NS) hatását az emberi osteosarcoma sejtekre U-2 OS a mátrix metalloproteinázok (MMP), az MMP-2 és MMP9 citotoxicitásának és szabályozásának, valamint az invazív potenciál mérésével.
Módszerek és anyagok
Sejtkultúrák
Humán osteosarcoma U-2 OS-sejteket az ATCC-től (American Type Culture Collection, Rockville, MD) nyertünk, és McCoy táptalajon tenyésztettünk, kiegészítve 10% marha-magzati szérummal, penicillinnel (100 E/ml) és streptomicinnel (100 mg/ml ) 24 üreges tenyészlemezeken (Costar, Cambridge, MA). A sejteket 1 ml tápközeggel inkubáltuk 37 ° C-on szöveti tenyésztő inkubátorban (inkubátorban) 95% levegővel és 5% CO 2 -val. Összeolvadáskor a sejteket tápanyag-szinergiával kezeltük, feloldottuk a táptalajban és 0, 10, 100 és 1000 mM koncentrációban teszteltük, mindegyik dózist három példányban. Ezután a lemezeket visszahelyeztük az inkubátorba. A reagensek citotoxicitását az ezt követő 24 órás inkubálás után ellenőriztük.
MTT teszt
Az életképességet/citotoxicitást sejtproliferáció után értékeltük MTT teszttel mind szérummentes, mind 10% PBS-sel kiegészített táptalajban. A sejtek szérummentes táptalaját eltávolítottuk és MMP-ket teszteltük. A lyukakban lévő sejteket foszfáttal kevert sóoldattal (PBS) mostuk, és mindegyik üreghez 500 ml 5 mg/ml PBS-ben oldott MTT-t (Sigma # M-2128) adtunk. A tenyésztő lemezeket további 2 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. A táptalajt gondosan leszívtuk, és mindegyikhez 1 ml DMSO-t (dimetil-szulfoxid) adtunk a képződött kék formazánkristályok feloldására. Az optikai sűrűséget 590n-nél mértük. Az egyes üregek DMSO-oldatának OD 550 értékét közvetlenül a BioSpec 1501, Shimadzu spektrofotométerrel vizsgáltuk. Az egyes üregekben a DMSO-oldat OD 590-ét a sejtek számával arányosnak tekintettük. A kontroll OD 590 értékét (kezelés hozzáadás nélkül) 100% -nak tekintettük.
Zselatináz-szimbólum
Az alapértelmezett táptalajban az MMP expresszióját zselatináz zymográfiával határoztuk meg. A zselatináz-zimográfiát 10% -os poliakrilamid-gélben (Bio-Rad, Hercules, CA) 0,1% gél jelenlétében vizualizáltuk. A táptalajt (20 ml) betöltöttük, és az SDS-PAGE-t Tris-glicin pufferrel mutattuk ki. Elektroforézis után a géleket 5% Triton X-100-mal mossuk 30 percig. Mosás után a géleket 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk 50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 5 mM ZnCl 2 (pH 7,5) jelenlétében és 30 percig Coomessie blue R 0.5-vel. % foltos és ismét foltos. A fehérje normákat folyamatosan követtük, és meghatároztuk a hozzávetőleges molekulatömeget.
Matrigel inváziós tanulmányok
Az inváziós vizsgálatokat Matrigel-betétek (Becton Dickinson) alkalmazásával végeztük a 24-lyukú lemezeken. A kísérlet tervében meghatározott tápanyaggal töltött tápoldatban szuszpendált osteosarcoma sejteket helyeztük a mélyedésekbe. A betéten és a tálakban lévő táptalaj egyaránt ugyanazokat az adalékokat kapta. Ezután a betétekkel ellátott lemezeket 24 órán át 95% levegővel és 5% szén-dioxiddal kiegyensúlyozott tenyésztő inkubátorban inkubáltuk. Az inkubálás után a táptalajt eltávolítottuk a mélyedésekből. A párnák felső felületén lévő cellákat vattapamacsokkal óvatosan kikapartuk. Azokat a sejteket, amelyek behatoltak a Mitragel membránba és a matrigel alsó felületére vándoroltak, hematoxilinnel és eozinnal festettük, és optikailag megszámoltuk mikroszkóp alatt.
1. táblázat - A tápanyagok szinergiájának összetétele
Az alábbiakban bemutatott arányoknak megfelelő tápanyag-szinergia törzsoldatot feloldottunk egy táptalajban, amint azt a kísérlet tervezése jelzi a sejtek kezelésére.
Statisztikai analízis
Az eredményeket átlagértékekként + SE csoportként adtuk meg. Az adatokat független "T" teszttel elemeztük.