ÁLLATI KÍSÉRLETI VIZSGÁLAT A FARMAKONBE TÖLTETT, BOMAGOLHATÓ
1 A Rostocki Orvostudományi Egyetem általános, mellkasi, érrendszeri és transzplantációs sebészeti klinikája és poliklinikája ÁLLATI KÍSÉRLETI VIZSGÁLAT A FARMAKONBE TÖLTETT BIOLÓGIAINDULÍTHATÓ POLILAKTID STENTEK IN VIVO VIZSGÁLATÁN Nyitó disszertáció a Rostockai Egyetemen született doktori fokozat megszerzéséhez Krasznodarban. Rostock, 2007 urn: nbn: de: gbv: 28-diss
2 dékán: Prof. Dr. med Wolfgang Schareck 1. értékelő: 2. bíráló: 3. bíráló:
3 Hála a szüleimnek
4 TARTALOMJEGYZÉK. 1 1 BEVEZETÉS Stentek az érsebészetben Megalapozott javallatok és az arteria carotis innovatív stentelése Az ideális sztent Fém stent A stent beültetésének problémái: Trombózis és restenosis Megoldási stratégiák Antitrombotikumok Fém stent gyógyszer felszabadítással: Sirolimus Biológiailag lebomló sztentek Fém stent ÉS polimer stent gyógyszerkibocsátással ANYAGOK KÖZLEMÉNY Stentek Vizsgálati állatok és preoperatív kezelés Anesztézia, intubáció és lélegeztetés Monitoring és gyógyszeres kezelések Sebészeti eljárás Iliac anastomosis modell ACC modell Operáció utáni kezelés és nyomon követés Mintavétel és szövettan Statisztikai értékelés EREDMÉNYEK Iliac anastomosis modell Sebészeti eljárás Utánkövetés Szövettani értékelés ACC modell Sebészeti eljárás Szövettani értékelés
5 5 MEGBESZÉLÉS Sertésmodell A PLLA sztent biológiai és fizikai tulajdonságai In vivo polimer stentvizsgálat ÖSSZEFOGLALÓ AZ IRODALOM LISTÁJÁRÓL RÖVIDÍTÉSEK FELSOROLÁSA ÁBRÁK LISTÁJA TÁBLÁZATOK TUDOMÁNYOS TELJESÍTMÉNY JELENLEGI TANANYAG ALAPVETÉS
12 A fémstent tartófunkciója nagymértékben segíthet a rugalmas visszarúgás megelőzésében, de nem gátolhatja a neointimális hiperpláziát, amely a stent restenosis patogenezisének másik meghatározó tényezője [47]. 1. ábra: Inointens restenosis neointimális hiperplázia miatt, bal: szövettani keresztmetszet, jobb: makroszkopikus keresztmetszeti kép, [MB Leon jóvoltából, Presbyterian Hospital, New York, USA.] Ez az érfal reakcióját mutatja a legfinomabb mechanikai elváltozásokra. Az endoteliális denudáció után a szubendoteliális struktúrák véráramba kerülése az érfal gyulladásos reakciójához vezet. A citokinek és növekedési faktorok, például a thrombocyta eredetű növekedési faktor (PDGF), az epidermális növekedési faktor (EGF), a ß transzformáló növekedési faktor (TGF ß) és a heparinázok felszabadulásával ez a tunika simaizomsejtjeinek aktiválódásához és proliferációjához vezet média. 9 után
14 kontrollcsoport [52]. A stentek helyi heparin bevonatát a BENESTENT II tanulmány publikálása óta klinikailag megállapították [53]. Ezek állítólag gátolják az érfal gyulladásos reakcióját és blokkolják a simaizomsejtek szaporodását. 1. táblázat: farmakológiai szerek Gyulladáscsökkentő, hogy csökkentse a restenosis Immunodulatoren anti-migrációs inhibitorok Proliferativa Reendothelisationsfaktoren dexametazon M-prednizolon interferon y-1b, leflunomid, szirolimusz, takrolimusz, everolimusz zotarolimus mikofenolsav mizoribin ciklosporin aktinomicin metotrexát angiopeptin, vinkrisztin, mitomicin sztatinok batimasztát prolii hidroxiláz inhibitorok, halofuginon C-proteináz inhibitorok, probukol BCP671 VEGF ösztradiol NO donor EPC antitestek 11
22 Neointimal Hyperplasia Injury Score Az érfal gyulladásos pontszámának sérülési foka A gyulladás mértéke Az összegyűjtött adatokat elemezzük, összehasonlítjuk egymással, és a PLLA sztent in vitro vizsgálata kapcsán vitatjuk meg, melyeket a Rostocki Egyetem Biomedicina Műszaki Intézetében rögzítettek. 19-én
23 3 ANYAG ÉS MÓDSZEREK 3.1. Sztentek A fém stenteket (Phainon 6,0 x 26 mm, merevítő átmérője 155 m) rozsdamentes acélból (316 L) készítettük amorf szilícium-karbid bevonattal, majd gázsterilizáltuk. A kialakítás megfelel a kereskedelemben kapható PEIRON rendszernek (Biotronik GmbH & Co. KG, Berlin, Németország). A ballon katéterrel történő bővítés másodpercek alatt 8 bar-ra történik, a sztent megrepedésének veszélye nélkül. A biológiailag felszívódó poli-L-laktid (PLLA) sztenteket a Rostock Warnemünde Egyetem Biomedicina Technológiai Intézetében fejlesztették ki és gyártották [16]. 2. ábra: Ballon-tágítható PLLA stent (A) és után (B) ballon dilatáció A rúd hossza = 10 mm. 20
24 A gyártáshoz nagy molekulatömegű poli L-laktidot (PLLA; Resomer L214, MG = g/mol, Boehringer, Ingelheim, Németország) használnak. PC-vezérlésű, részben automatizált bevonatolási eljárás (merülő bevonat) során a rozsdamentes acél magházakat (átmérője 2,8 mm, hossza 40 mm) egy merülő robot segítségével PLLA/kloroform oldatba süllyesztik. Az oldatot egy fecskendőrendszer segítségével automatikusan újratöltik, hogy biztosítsák a merülő magok egyenletes nedvesedését. A mártási folyamatot addig ismételjük, amíg a kívánt falvastagságú, 270 m-es kabát létre nem jön. Ezt két tengelyes lézeres mérőfejjel való érintkezés nélkül mérik (ODAC 32 XY, ZUMBACH Electronic, Orpund, Svájc). Ezután a polimer csöveket szikével eltávolítjuk a dugattyúból, és vákuumban 40 ° C-on szárítjuk, amíg a 2% -nál kisebb kloroform-tartalom el nem éri. A vízzel és metanollal végzett utolsó mosási folyamat a maradék kloroform eltávolítását szolgálja. A második lépésben a csöveket ezután CO2 lézerrel (Wild Emco Lasertec, Hallein, Ausztria) elvágják. 3. ábra: bal: merülő robot, jobb: CO2 lézer 21
25 A vágások CNC vezérlésűek. A rögzítéshez a polimer csöveket egy kerámia tüskére helyezzük, amely lehetővé teszi a lézer előre, hátra és forgás közbeni mozgását. Az összes vágási út kétszer halad át, így az anyag teljesen átvágódik. A végeredmény egy mm-es és 270 m-es átmérőjű PLLA-sztent, amelyet egy utolsó lépésben egy PLLA Sirolimus oldat 70:30 arányú permetezésével, a gyógyszerpermet bevonatával fejezünk be. 4. ábra: Permetező bevonat - a bevonat oldatának permetezése Az oldat összetétele előzetes vizsgálatok eredménye, amelyek azt mutatták, hogy a szirolimusz csak legalább 20% -os koncentrációban szabadult fel [16]. A kapott Pharmakon bevonat 1,5 g/mm 2 körül van. A sztent felhasználásáig száraz helyen, 20 ° C-on tároljuk az eltarthatóság növelése érdekében. Mivel a sterilizálás a viszkoelasztikus tulajdonságok csökkenésével jár [15, 16], ez nem történik meg. A sztent etanollal történő egyperces fertőtlenítése közvetlenül a beültetés előtt történik. 22-én
31 Az anasztomózis folyamatát kizárólag ugyanaz a sebész (C.M.B.) végzi 2,5-szeres nagyítású prizmatikus nagyító segítségével, a műtéti technika lehető legnagyobb mértékű szabványosítása érdekében. 6. ábra: Kétágú protézis beültetése aortobiiliakal; intraoperatív situs. A stent beültetése randomizált. A sztent előkészítésével (3.1.) Párhuzamosan a közös iliaca artéria proximális (Satinski bilincs) és disztális végtagját (Bulldog bilincs) szorítják ki az állatra, valamint a rögzített protézis végtag kb. 0,5 cm hosszú, keresztirányú metszését 2 cm az anastomosis közelében. Az edény mindkét oldalát átöblítjük a bemetszésen, és heparin asztali sóval öblítjük át. Az Overholt-szal történő előnyújtás után a 6/40 mm-es ballonkatéterre (PHERON, Biotronik, Berlin, Németország) krimpelt sztentet visszavezetjük az anastomosis terület közepére, és vizuális ellenőrzés alatt fokozatosan kiterjesztjük. 28.
32 7. ábra: A sztent beültetése vizuális ellenőrzés mellett A sztentet kitágítják a ballonkatéter 8 bar-ra történő felfújásával. A fent leírtak szerint a fém-sztent másodpercek alatt kibővül, míg a PLLA-sztent tágulása 8 percet vesz igénybe (1 bar/perc). A katéter újrapozícionálása után az eléréshez szükséges bemetszést egygombos varratokkal (Prolene 6.0 BV) lezárjuk, és a közös csípőartériát kitesszük a bulldog eltávolítása után. Végül ellenőrizzük az állat létfontosságú paramétereit. 29.
33 8. ábra: A csípő anasztomotikus stentjének felfúvódása, amely makroszkóposan látható az érfalon keresztül. Miután a sztenteket sikeresen behelyezték az erekbe, az artériás katétert eltávolítják, és az aortát Prolene-vel lezárják. Ezt követi 1,5 g ampicillin/szulbaktám (Unacid) intravénás beadása és a has öblítése NaCl gentamicin oldattal, mindkettő antibakteriális profilaxis céljából. A suprapubicus vizeletkatéter Z-varrattal (Vicryl 3.0 SH) lezárása és a bélhurkok újrapozícionálása után a retroperitoneumot folyamatosan újranyitják egy 3.0-val. Vicryl-varrat és a hashártya Mersilene-vel záródott. A szubkután varratot szintén futó 3.0-val végzik. Vicryl varrat, a bőrt jodidoldattal történő fertőtlenítés után felszívódó fonallal varrják. Ezenkívül 40 mg enoxaparint (Clexane) és 5 ml széles spektrumú antibiotikum oxitetraciklint (Terramycin, Pfitzer Animal Health, Exton, USA) adunk szubkután a gluteális izmokba. 30-án
A 35-et egyszer és reggel adják be. A disznót visszaszállítják az állatházba. Doppler-szonográfia: Az aortoiliacus erek Doppler-szonográfiás vizsgálatát intraoperatív módon (protézisek után és stent beültetés után), valamint két és hat héttel a beültetés után végezzük. A femorális artériás maximális véráramlást (Fmax, khz) a folyamatos hullám technikával határozzuk meg a distalis anastomosis áramlási tulajdonságainak értékelése céljából. 9. ábra: A combcsont véráramlásának Doppler-szonográfiás vizsgálata Számítógépes tomográfia: A sztent átjárhatóságának időbeli meghatározásához egy, kettő után kontrasztanyaggal segített, számítógépes tomográfiai vizsgálatokat (Tomoscan AV, Philips Németország; Aquileon TSX 101A, Toshiba, Németország) hajtanak végre. négy és hat hét a 32. kötet felhasználásával
36 renderelési technika (VRT), amely lehetővé teszi a felületek és szerkezetek egyidejű megjelenítését, és a maximális intenzitású vetítést (MIP), egy speciális volumetrikus megjelenítési technika. Az állatokat használtuk a vizsgálatokhoz a 3.3. Szakasz szerint. leírt, nyugtatott. 10. ábra: CT aorto-iliac régió. Mindkét sztent folyamatos. Nagy nyíl: fém stent, törött nyíl: PLLA sztent (nem röntgensugárzó) Mintavétel és szövettan: Annak érdekében, hogy hisztomorfológiai és planimetriai szempontból értékelhessük a stent területén a vaszkuláris és perivaszkuláris szakaszokat, a stent hordozó érszakaszokat, valamint a protézishez vagy a a natív hajó 6 hét elteltével robbant ki. 33
38 1. szint: 2. szint: 3. szint: Az anastomosis stent és a protézis proximálisa Anastomosis varrat Az anastomosis stent és az edény disztálisa Az edénymintákat 10 m rétegvastagsággal elvágjuk, hematoxilin/eozin (H.E.) oldatban megfestjük és szárítjuk. Hisztoplanimetria: Annak érdekében, hogy a szövettani metszeteket morfometrikusan értékelhessük, mikroszkópokhoz készült digitális kamerarendszerrel (Axioskop 40, Axio Cam MRc5, Carl Zeiss, Hamburg, Németország) lefényképezzük őket, és PC-re helyezzük át. Valamennyi részt digitalizáljuk planimetriai elemzésekhez, és kiértékeljük az Image J szoftverrel (1.32j verzió) a nemzeti egészségügyi intézet honlapjáról (. Az erek poszt-intervenciós átjárhatóságának értékeléséhez a maradék lumen átmérője (RL, mm) az 1. szinten)., 2 és 3 hat mérésben, a lumen oldalán lévő neointimális határ alapján, 60% -os szögben meghatározva és az aritmetikai átlag alapján számítva. A neointimális hiperpláziát az átlagos intim vastagságból (MID, mm) határozzuk meg, amely a 3. szint támasztengelyei felett van. mértük, meghatároztuk a 35-öt
39 Hisztomorfológia: A hisztomorfológiai kiértékelést két független vizsgáló végzi, akik vakok vannak a sirolimus jelenlétére a PLLA stentekben. Sérülési pontszám A sztent által okozott érfal károsodásának mértékének szemikvantitatív értékeléséhez fénymikroszkóppal 4 egymást követő, az anastomózistól disztális metszést vizsgálunk meg, és létrehozunk egy sérülési indexet. A szekcionált készítmény minden egyes támaszát kiértékelik és numerikus pontszámokat rendelnek hozzá (0 3): 0 lamina elastica interna (LEI) sértetlen, tunika táptalaj nincs összenyomva, sérülés nincs 1 LEI sértetlen vagy kissé hasított, közeg tömörített, nem hasított 2 LEI és tunica táptalaj hasított, adventitia intact 3 lamina elastica externa (LEE) perforált, adventitia sérült vagy perforált. Az összes pontszámot összeadjuk, és elosztjuk az értékelt támaszok számával annak érdekében, hogy a teljes stent sérülési pontszámát megkapjuk [48]: Sérülési pontszám (IS) = az összes pontszám összege, az értékelt támaszok száma 36
40 Gyulladásos pontszám Ezt a pontszám osztályozást használják a stent beültetését követő gyulladásos szöveti reakció mértékének és sűrűségének rögzítésére. Ebből a célból minden egyes strutot szemikvantitatív módon megvizsgálnak a gyulladásos sejtek jelenlétére vonatkozóan négy egymást követő szakaszban, disztálisan az anastomózistól, és numerikus pontszámokat (0 3) rendelnek hozzá: 0 nincs gyulladásos sejt 1 a limfociták és hisztociták enyhe szubintimális beszivárgása 2 helyi közepes vagy sűrű sejtaggregátok 3 sűrű infiltráció A teljes sztrut körülvevő limfociták és hisztociták A teljes stent gyulladásos pontszáma az egyes pontszámok és az értékelt strutok számának eloszlásából adódik [93]. IF = az összes pontszám összege kiértékelt támaszok száma 3.8. Statisztikai értékelés: a műtét alapvető paraméterei és a szövettani adatok az átlagos eltérés +/- szórás formájában kerülnek bemutatásra. A különbségeket statisztikailag hasonlítjuk össze a nem párosított kétfarkú T teszttel. A Doppler-ultrahang méréseinek ábrázolása aritmetikai átlag segítségével. Az adatok 37
44 Doppler utólagos szonográfia: A protézis beültetése után a folyamatos hullámú Doppler szonográfia a szisztolés véráramlás amplitúdójának csökkenését mutatja, amelyet a stent beültetése megfordít. Hat hét elteltével a femorális véráramlás nem csökkent hemodinamikusan a fém és a sirolimusszal bevont PLLA stentek csoportjában. Ezzel szemben a PLLA stentek csoportjában csökken az Fmax. Számítógépes tomográfia: A számítógépes tomográfián 6 hét után minden stentált csoport nyitott lumenű. A bevonat nélküli PLLA csoport szűkületet jelző szabálytalanságokat mutat. Ezzel szemben a Sirolimus PLLA csoportban szinte zavartalan artériás áramlás látható. A fémstentelés utáni lumen értékelése problematikus, mivel a fém műtermékeket állít elő a számítógépes tomográfiában. 41
45 11. ábra: CT aortoilical. Mind a protézis lábak, mind az AIC nyitva vannak (jobb fém, bal PLLA). A PLLA sztent területén vannak olyan szabálytalanságok, amelyek a lumen mérsékelt szűküléséhez vezetnek Szövettani értékelés Minden stent hordozó szegmens folyamatos, nincs trombotikus elzáródás. A szövettani értékelés nem mutat túlzott visszahúzódást vagy egy sztent összeomlását. Sérült körmetszés minden példányban megtalálható. 42
46 12. ábra: Szövettani metszet a nyitott fém (*) és a PLLA (**) sztentek bizonyítékáról. A stentrudak (S) felett neointimális hiperplázia látható, ami a PLLA-ban kifejezettebb. HE festés, eredeti nagyítás 12,5 x. 13. ábra: SIR-PLLA sztent szövettani metszete. Csak minimális neointimális hiperplázia van a sztentrudak felett (S). van. HE festés, eredeti nagyítás 12,5 x. 43
50 Szövettani kiértékelés: az összes sztent szegmens nyitott lumenet mutat, a tesztsorozatban nem volt trombotikus elzáródás. A szövettani értékelés intakt körkörös sztentmetszést tár fel minden szegmensben; nincs utalás a sztent túlzott visszahúzódására vagy összeomlására. 17. ábra: Szövettani metszet az ACC területén, bal oldalon fém, jobb oldalon PLLA. Látható egy neointima kialakulása a stent-támaszok felett (S), ami a PLLA-ban kifejezettebb. HE festés, eredeti nagyítás 12,5 x. 47