Az AP-1 komplexum σ1 alegységeinek knock-out egérmodelljeinek létrehozása és elemzése - PDF
Az AP-1 komplex disszertáció σ1-alegységeinek kiütéses egérmodelljeinek elkészítése és elemzése a göttingeni Georg-August-Universität matematikai és természettudományi karainak doktori fokozatának megszerzéséhez Jennifer Baltes, Saarbrücken Göttingen, 2008
D7 Előadó: Prof. Dr. K. von Figura Biokémiai Intézet II., Biokémiai és Molekuláris Sejtbiológiai Központ, a göttingeni Georg-August Egyetem társ-témavezető: Prof. Dr. R. Ficner Mikrobiológiai és Genetikai Intézet, a göttingeni Georg-August Egyetem, a szóbeli vizsga napja: 2008. január 22.
Tartalomjegyzék I. Tartalomjegyzék 1. Bevezetés. 1 1.1 Vezikuláris szállítás. 1 1.1.1 Clathrin. 4 1.1.2.1. AP-1 közvetítette vezikulák képződése. 11 1.1.2.2. Adapter fehérje komplex felismerési motívumok. 13 1.1.2.3. Az AP-1 kölcsönhatásai kiegészítő fehérjékkel. 16 1.1.3 GGA adapterek. 19 1.1.4 AP-1 közvetített szállítás. 22 1.2 Az AP-1 Adaptine egér kiütési modelljei. 25 1.2.1 A γ-knock-out egerek fenotípusa. 25 1.2.2. A µ1 knock-out egerek fenotípusa. 26 1.2.3 A σ1b kiütéses egerek fenotípusa. 26 2. Kérdés. 28 3. Anyag és módszerek. 29 3.1 Gyakran használt megoldások és eszközök. 29 3.1.1 Pufferek. 29 3.1.2. Táptalajok. 29 3.1.3 Eszközök. 30 3.1.4 Centrifugák és rotorok. 30 3.2 Molekuláris biológiai módszerek. 31 3.2.1 Genomikus DNS izolálása farokbiopsziákból. 31 3.2.2 A DNS kicsapása etanollal. 31 3.2.3 A DNS fenol-kloroformos extrakciója. 32 3.2.4 RNS izolálás a szövetekből. 32 3.2.5. A nukleinsavak mennyiségi meghatározása. 33 3.2.6 PCR. 33 3.2.6.1. PCR-megközelítés az σ1b -/- - egerek genotipizálásához. 35 3.2.6.2. PCR az σ1a Gene Trap egerek genotipizálásához. 36 3.2.7 A DNS restrikciós emésztése. 38 3.2.8 A DNS szétválasztása gélelektroforézissel agarózgéleken. 38 3.2.9 DNS kivonása agaróz gélekből. 40 3.2.10 DNS-fragmensek ligálása. 41
Tartalom III 3.5 Fehérje biokémiai módszerek. 58 3.5.1 A teljes sejtből származó fehérje extrakció a sejtekből. 58 3.5.2 Szöveti homogenátum előállítása. 58 3.5.3 Fehérje meghatározása Bradford szerint. 59 3.5.4 Poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-oldal) Laemmli szerint. 59 3.5.5 Fehérje transzfer nitrocellulózba (Western blot). 62 3.5.5.1. Félszáraz blot. 63 3.5.5.2. Nedves folt. 3.5.5.3 Immunfestés nitrocellulóz/PVDF membránokon. 64 3.6 egyéb módszerek. 66 3.6.1. ELISA a különböző adipokinek szérumkoncentrációinak mérésére. 66 3.6.2 Az izolált adipociták FACS (fluoreszcenciával aktivált sejtek szortírozása) elemzése. 67 3.6.3 Adipociták festése olajvörös O-val. 67 4. Eredmények. 69 4.1 A σ1b-hiányos egér törzs fenotipizálása. 69 4.1.1 A σ1b-hiányos egerek vízháztartása. 69 4.1.2 σ1b-hiányos egerek szérumanalízise. 78 4.1.3 A zsírszövet σ1b-függő funkciója. 79 4.1.3.1 A zsírszövet jellemzése. 80 4.1.3.2 A zsírszövet funkcionális vizsgálata. 83 4.1.3.2.1. Σ1b-hiányos egerek glükóz toleranciája. 83 4.1.3.2.2. Adipocitokinek koncentrációja a szérumban. 85 4.1.2.3.2. A magas zsírtartalmú étrend hatása a σ1b-hiányos egerek súlyára. 87 4.1.3.3 A zsírszövet differenciálása. 90 4.1.4 Viselkedési vizsgálatok σ1b-hiányos egereken. 100
Rövidítések V Rövidítések Å Ångström Ábra Az ábra kitöltése az a.d. aqua destillata ADP adenozin-difoszfát AP adapter fehérje komplex APS ammónium-perszulfát ARF ADP-ribosilációs faktor BFA Brefeldin A bp bázispár BSA szarvasmarha szérum albumin C fok Celsius fok CCV clathrin bevonatú hólyag cdna komplementer DNS Ci Curie (2,22x10 6 szám percenként) COP trifoszfát dCTP dezoxicitidin-trifoszfát DEPC dietil-pirokarbonáttal dGTP dezoxi-guanozin-trifoszfát azaz DMEM Dulbecco-féle módosított Eagle Medium dNTP dezoxiribonukleotid DMSO dimetil-szulfoxid DNS dezoxiribonukleinsav DTT EDTA dezoxiribonukleinsav E. colo-trifoszfát Eithiothreitol dttpiphosphate
Rövidítések VI EGF epithelialis növekedési faktor ELISA Enzimmel kapcsolt immunszorbens teszt Engerizált ENTH epsin N-terminális homológia ER Endoplazmatikus retikulum ERGIC ER-Golgi köztes rekesz ES embrionális őssejtek és mtsai. et alii (lat.: és mások) EtBr etidium-bromid FACS fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás FKS magzati borjúszérum g gramm GAE γ-adaptin-fül-homológ GAP GTPáz-aktiváló fehérjék GAPDH glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz GGA és TOM1 GDP guanozin-trifoszfát GDP-nukleotidcseretényező GGA Golgi-lokalizált, γ-fül tartalmú, ARF-kötő fehérjék GLUT4 glükóz transzporter 4 GTP guanozintrifoszfát óra óra H 2 O víz azaz 2 O desztillált víz HRP torma peroxidáz IgG immunglobulinG ip intraperitoneális k kil kb kilobázisok ko kiütik L liter LB lizogenitás húsleves M moláris
Rövidítések VII ma milliamper MEF egér embrionális fibroblasztok mg milligramm perc perc ml milliliter mm milliméter mm millimoláris mmhg milliméter higany MOPS 3- (N-morfolino) -propánszulfonsav MPR mannóz-6-foszfát receptor mrna messenger nm ribonukleinsav µg nanométer mikroliter nanogramm n-terminális aminoterminális OD optikai sűrűség PAA poliakrilamid PBS foszfáttal pufferolt sóoldat PCR polimeráz láncreakció ph protonkoncentráció negatív dekadikus logaritmusa, 5-biszfoszfát PM plazma membrán pm pikomoláris PP2A fehérje foszfatáz 2A PVDF polivinilidén-difluorid RNS ribonukleinsav RNSse ribonukleáz RT szobahőmérsékletű fordulat/perc fordulat percenként lásd SDS nátrium-dodecil-szulfát
Rövidítések VIII SNARE SSC sec Tab. Taq TE TEMED TGN Tris U ü.n. UV V lásd VHS WT w/v v/v xg pl. "SNAP és NSF kötődési receptorok" standard sóoldat-citrát második asztal Thermophillus aquaticus Tris/HCl EDTA N, N, N, N tetrametil-diamin transz-Golgi hálózat trishidroxi-metil-amino-metán enzim egység (egység) éjszakai ultraibolya fényvoltok összehasonlítják a vad típusú Vps27p, Hrs és STAM A térfogat és a térfogat aránya például a gravitáció miatti gyorsulás szorzata
A 7. bevezetés kolokalizálva van (Simpson és mtsai, 1997; Peden és mtsai, 2004). A mai napig nem találtak AP-3-t az agyszövetből származó tisztított CCV-kben (Simpson és mtsai, 1996; Dell'Angelica és mtsai, 1997b; Blondeau és mtsai, 2004). A mutált AP-3 klathrin kötő motívummal végzett funkcionális vizsgálatok szintén nem mutattak kölcsönhatást. Úgy tűnik azonban, hogy a sejtben léteznek klathrin-asszociált, valamint klathrin-mentes populációk (Peden et al., 2004). AP-3-hoz kötött CCV-k izolálhatók a HeLa humán hámdaganatos sejtvonalból (Borner et al., 2007). Ezért lehet, hogy a klathrin-AP-3 kötése nagyon törékeny, vagy hogy az AP-3-kötő, klatrinnel bevont vezikulák mennyisége különböző sejttípusokban változik (Newell-Litwa et al., 2007). Az AP-4 komplex nem rendelkezik klasszikus clathrin boxdal, és specifikus interakciót nem észleltek. Azonban az AP-4-et a klatrrin közelében detektálták elektronmikroszkópos felvételeken (Barois és Bakke, 2005). 3. ábra: Adapterfehérjék által közvetített specifikus transzportutak TGN: Trans-Golgi hálózat; b ee: bazolaterális korai endoszóma; a ee: csúcsos korai endoszóma; Lys: Lysosom, re: az Endosom újrahasznosítása további magyarázatokért lásd a szöveget (Schu, 2005 után).
A 9. bevezető kötési hellyel rendelkezik, de a µ1 alegység, ellentétben a µ2-vel, nem rendelkezik foszfatidil-inozitol-foszfát-kötő motívummal. 4. ábra: Az (a) AP-1 és (b) AP-2 szerkezete és összetétele Az egyes alegységeket a megfelelő színekkel azonosítjuk a (b) és (d) sémák szerint. A megfelelő YxxΘ kötőhelyet ovális, a PI-4-P kötőhelyet emeli ki az AP-1-ben, és a PI-4,5-P2 kötő helyet az AP2-ben egy D-mio-inozitol-hexakiszfoszfát (IP6) foglalja el egy körrel. A µ2 alegységhez képest az AP-1 µ1 alegységétől hiányzik a foszfatidil-inozitol kötőhely. (Collins és mtsai., 2002; Heldwein és mtsai., 2004) Az adapterkomplexumok magja körülbelül 100 Å x 80 Å, a két nagy alegység csuklótartománya valószínűleg 200-300 Å-ig terjed. nincs stabil másodlagos szerkezete. Ezért a füldomének a komplex membránhoz kötött magjától távol helyezkedhetnek el, és kölcsönhatásba léphetnek a citoplazmában található más fehérjékkel.
Bevezetés 10 5. ábra: Az AP-1 alegységek különböző izoformáinak sematikus ábrázolása. Két izoforma ismert mind a y, mind a µ1 esetében. Még három izoformát is leírtunk a σ-ra. A σ1b-t három toldási variánsban detektáltuk. Sok adaptin esetében emlősökben olyan izoformákat írtak le, amelyeket több gén kódol. Csatlakozási variánsokat csak az α-adaptin esetében találtunk. Az AP-1 esetében legalább egy alternatív izoform expresszálódik az összes érintett fehérjére, a β1 alegység kivételével. Ezeknek a fehérjéknek a vázlatos összeállítását az 5. ábra mutatja. A y2 izoform 60% -ban homológ a y1 adaptinnel. A változó csuklós tartományban rövidül. A γ1 alegységgel ellentétben az yeastwo hibrid rendszerben nem mutatható ki kölcsönhatás a γ2 és a β alegység között. Ez arra utal, hogy nincs in vivo komplex a γ2-vel. Három gén ismert a σ1-adaptinről, a σ1a, -B és -C. 70-80% azonosságot mutatnak fehérjeszinten (Riel, 2004). In vitro a σ1a és a σ1b mindkét γ-izoformához kötődik (Takatsu et al., 1998; Takatsu et al., 2001). Emellett laboratóriumunkban három különböző toldási variánst készítettek
Bevezetés 15 Általában több savas aminosavmaradék megelőzi ezeket, ezeket savas fürt dileucin motívumoknak is nevezzük. Ebben az esetben az aszpartát (D) nem pótolható. A (D, E) xxxL (L, I) jelekkel szemben a DxxLL nem in vitro kötődik az AP komplexekhez, hanem a GGA család monomer adaptereihez (Puertollano et al., 2001; Zhu et al., 2001 ) (lásd 1.1.3). A válogató motívumok egy másik családja egy aminosav-szekvenciából áll, amelyek egy-három foszforilációs helyet tartalmaznak a kazein-kináz II (CKII) számára. Ez a motívum megtalálható számos transzmembrán fehérjében, amelyek a TGN és az endoszómák között keringenek. A CK-II által történő foszforilezés elsősorban az endoszómákból a TGN-be történő visszatéréshez szükséges. A PACS1 fehérje (foszfofurin savas, klaszter szerinti válogató fehérje 1) esetében kimutatható volt, hogy a foszforilezett, savas csoportokat, valamint az AP-1 és AP-3 kötődik. Az AP-1 kötőfelületét µ-n és σ-n azonosítottuk (Wan et al., 1998; Crump et al., 2001).
Bevezetés 16 1.1.2.3. Az AP-1 kölcsönhatásai kiegészítő fehérjékkel 6. ábra: Az AP-1 hálózata és interakciós partnerei Az egyes fehérjék közötti összekötő vonalak kölcsönhatást szimbolizálnak. További interakciós partnereket írtak le, amelyek vélhetően az AP-1 CCV-k specifikus környezetét generálják. Ezen kiegészítő fehérjék többsége az AP-1 nagy alegységeinek füldoménjeihez kötődik, a y1 kölcsönhatásoknak van a legnagyobb affinitása. Mivel ezek a tartományok mutatják a legkevesebb hasonlóságot az adaptinek között, nagyon specifikus kapcsolatok jönnek létre. A 6. ábra az AP-1 kötő fehérjéket mutatja be, és a komponensek közötti kölcsönhatásokat vonalak jelzik. Ezeknek a fehérjéknek nem mindegyike tárgyalható alább részletesen, ezért csak azokra szorítkozom, amelyekről a legtöbb információ áll rendelkezésre. Ezen fehérjék többségének funkciója ismeretlen, és az AP-1-hez való kötõdés fontosságát csak kevesen vizsgálták. Ez utóbbi csoportba tartozik az ARF1GAP, amely a fehérjeburkolat feloldásához szükséges. Használhatja a Rabaptin5-et is
Bevezetés Az azonosított motívumok, a WVQF és a WGDF után 19 aminosav keletkezik ezekben a kapcsolódó fehérjékben (Mattera és mtsai, 2004). 1.1.3 GGA adapterek A monomer GGA fehérjék (Golgi-lokalizált, γ-fültartalmú, ARF-kötő fehérjék) hozzájárulnak a klatrinnel bevont fehérjék kialakulásához a TGN-en. A GGA-fehérjéket az egyik doménjük γ-adaptin-fül doménnel való homológiája alapján azonosítottuk az adatbázisokban, és megvizsgáltuk a TGN-nél zajló válogatási folyamatokban betöltött szerepüket (Bonifacino, 2004). Az endoszómákon is megtalálhatók. Három olyan gént írtak le emlősökben, amelyek kódolják a GGA1, GGA2 és GGA3 kódokat. A család konzerválódott eukariótákban, és az élesztőnek két GGA-fehérje is van. A GGA fehérjék moduláris felépítésűek (lásd 7. ábra). Három hajtogatott doménjét strukturálatlan szekvenciák kötik össze. 7. ábra: A GGA1 szerkezetének modellje Itt egyesítettük az egyes domének struktúráját, hogy modellt alkossunk, és kötődési partnereiket hozzárendeltük az egyes doménekhez. Módosítva (Ghosh és Kornfeld, 2004)