Az ateroszklerózis számszerűsítése egérprotokollban (németre fordítva)
Összegzés
Az érelmeszesedés rágcsálómodelljei hasznos eszközök a kórokozó útvonalak molekuláris szintű tanulmányozásához, de az elváltozások fejlődésének standardizált számszerűsítését igénylik. Ez a protokoll egy optimalizált módszert ír le a fő artériák elváltozásának meghatározására, beleértve az aorta gyökeret, aorta ívet és a brachiocephalic artériát.
Absztrakt
A szív- és érrendszeri betegségek a halálozás legfőbb oka a világon. A legtöbb esetben a kiváltó ok az arteriosclerosis, amely részben krónikus gyulladásos betegség. Kísérleti érelmeszesedési vizsgálatok tisztázták a koleszterin és a gyulladás szerepét a betegség folyamatában. Ez sikeres klinikai vizsgálatokhoz vezetett az atherosclerosis klinikai megnyilvánulásait csökkentő hatóanyagokkal. A betegség egérmodelljeivel végzett körültekintő és jól ellenőrzött kísérletek tovább tisztázhatják a betegség patogenezisét, amely nem teljesen ismert. A standardizált elváltozások elemzése fontos a kísérleti variabilitás csökkentése és a reprodukálhatóság növelése érdekében. Az aorta gyökér, aorta ív és a brachiocephalic artéria elváltozásának nagyságának meghatározása gyakori végpont a kísérleti érelmeszesedésben. Ez a protokoll technikai leírást nyújt az érelmeszesedés értékeléséhez ezeken a helyeken egyetlen egérben. A protokoll különösen akkor hasznos, ha az anyag mennyisége korlátozott, mint például a géntechnológiával módosított állatok jellemzésénél.
Bevezetés
A szív- és érrendszeri betegségek a vezető halálokok a világon, az iszkémiás szívbetegség és a stroke a negyedik halálesetet okozza 1. Az esetek többségét az érelmeszesedés okozza, amely betegség a lipidtartalmú plakkok lassú felhalmozódását jellemzi krónikus gyulladás jeleivel a nagy és közepes artériákban 2. A betegség általában évtizedekig észrevétlen marad, amíg a lepedék megrepedése vagy eróziója artériás trombózist okoz, ami iszkémiás szövetkárosodáshoz vezet.
A normál artéria egy bélrétegből áll, amely endothelsejtekkel és ritkán eloszlott simaizomsejtekkel, egy simaizomsejtekkel és rugalmas lamellákkal ellátott közegrétegből, valamint egy laza kötőszövetből álló környező adventiális rétegből áll. Az LDL intim retenciója kompenzálja az érelmeszesedés kialakulását 4. A lipoproteinek felhalmozódása és módosulása aggregációhoz és megrekedéshez vezet az artériás intimában 5. Gyulladásos választ a befogott és módosított lipoproteinek 6 okoznak. Az endoteliális sejtek elkezdik kifejezni az adhéziós molekulákat, például a VCAM-1-et az artériás fa turbulens véráramlású helyein, ami keringő monociták és más leukociták toborzását eredményezi 7. Az infiltrálódó monociták makrofágokká differenciálódnak, amelyek a lipidet elnyelik, majd makrofág habsejtekké alakulnak. .
Az érelmeszesedést az 1980-as évek közepétől növekvő gyakorisággal vizsgálták egérmodellekben. A C57BL/6 a leggyakoribb beltenyésztett egér törzs, amelyet ezekhez a vizsgálatokhoz használnak, és a genetikailag módosított 9 törzsek többségének genetikai háttereként használják. Ezt a törzset az 1920-as években alapították 10, genomját 11 2002-ben publikálták. Az egérmodellekkel végzett kísérleteknek számos előnye van: a telepek gyorsan szaporodnak, a ház helytakarékos, a beltenyésztés pedig csökkenti a kísérleti variabilitást. A modell genetikai manipulációkat is lehetővé tesz, például célzott géndeléciókat és transzgének inszercióját. Ez a betegség új patofiziológiai megértéséhez és új terápiás célokhoz vezetett 12.
A vad típusú C57BL/6 egerek természetesen ellenállnak az arteriosclerosisnak. A keringő koleszterin nagy része HDL-ben van, és komplex ateroszklerotikus elváltozások még akkor sem képződnek, ha magas zsírtartalmú és magas koleszterinszintű étrendet fogyasztanak 13. A hiperkoleszterinémiás egereket, mint például a C57BL/6 háttér Apoe -/-, ezért használják az arteriosclerosis 14, 15 kísérleti modelljeként. Az ApoE hiánya rontja a maradék lipoproteinek májfelvételét és súlyosan megzavarja a lipid anyagcserét. Apoe -/- egerekben a keringő koleszterin főleg a VLDL részecskékben kering, és az egerek bonyolult ateroszklerotikus plakkokat fejlesztenek ki rendszeres Chow étrenden.
Az Ldlr -/- egerek családos hiperkoleszterinémiában szenvedő emberekben utánozzák az arterioszklerózis kialakulását 16. Az Ldlr -/- egereknek nyugati étrendre van szükségük a fajta fajta kialakulásához 17. Az emberi fogyasztást utánzó nyugati étrend, amely általában 0,15% koleszterint tartalmaz. Az LDL-receptor felismeri az ApoB100-at és az ApoE-t, és közvetíti az LDL-részecskék endocitózis útján történő felvételét. Az LDL receptorok alapvető szerepet játszanak az LDL máj keringésből történő kiürülésében, míg a vérképző sejtekben az LDL receptor expressziója nem befolyásolja ezt a folyamatot. Ez megnyitja az Ldlr +/+ sejtek csontvelő-transzplantációjának lehetőségét a hiperkoleszterin Ldlr -/- befogadóban és az ateroszklerózis kialakulásának értékelését. A csontvelő kimérákat széles körben alkalmazták a vérképző sejtek kísérleti érelmeszesedésben való részvételének tanulmányozására. A csontvelő-transzplantáció azonban befolyásolhatja az érelmeszesedéses plakkok méretét és összetételét, így az eredmények értelmezése kétértelművé válik.
Az Apoe -/- és Ldlr -/- egerek különféle variánsait további genetikai módosításokkal fejlesztették ki a betegség specifikus folyamatainak tanulmányozására 18. Példaként említhetjük a humán APOB100-transzgénikus Ldlr -/- (HuBL) egereket, amelyek a teljes humán APOB100 gént hordozzák, 19, 20. Ezekben az egerekben hiperkoleszterinémia és érelmeszesedés alakul ki rendszeres chow-étrenden. A komplex ateroszklerotikus plakkok kifejlesztése azonban legalább hat hónapot vesz igénybe, és rövidebb kísérleti protokollok általában nyugati étrendet alkalmaznak 21. A plazma koleszterin nagy része az LDL részecskékben kering, ami a HuBL egereknek humánusabb diszlipidémiás lipoprotein profilt ad, mint az Apoe -/- és Ldlr -/- egerek. A HuBL egerek lehetővé teszik az emberi ApoB mint autoantigén vizsgálatát 22 .
Az érelmeszesedés egérmodelljei komplex ateroszklerotikus plakkokat fejlesztenek ki, amelyek az emberi betegségek közös jellemzőivel rendelkeznek. A plakkok azonban meglehetősen ellenállóak a későbbi szívinfarktusos repedésekkel szemben. Az aterotrombózis csak szórványosan bizonyított, és kísérletileg kihívást jelent a 23, 24, 25 értékelésére. Speciális plakktörési modelleket dolgoztak ki, de a kísérleti mezőből hiányzik egy megbízható és reprodukálható modell a plakkstabilizátorok értékelésére.
Az ateroszklerózis számszerűsítéséről az irodalom sok szempontból beszámolt. A legújabb erőfeszítések az állatkísérletek kísérleti tervezésének, lebonyolításának és jelentésének egységesítésére törekedtek 26. A nyomozók különböző preferenciákkal és technikákkal rendelkeznek a laboratóriumukhoz igazítva. A legtöbb kutatási projekt egyedülálló abban a tekintetben is, hogy bizonyos protokoll-változtatásokat igényel. A betegség multifaktoriális jellege miatt az optimális kontroll projektenként változhat. A helyi viszonyok és a szabványosítás hiánya megfigyelt eltérésekhez vezethet a betegség kialakulásában, ami akadályozza a kutatási terület előrehaladását. A kísérleti variabilitás különbségei azt is jelentik, hogy a statisztikai teljesítményszámításoknak helyi körülmények között végzett kísérleti vizsgálatokon kell alapulniuk.
Az érfában több helyen ajánlott az érelmeszesedés számszerűsítése. Ez a protokoll leírja, hogyan lehet egyetlen egérben eredményt szerezni az aorta gyökérből, az aorta boltívből és a brachiocephalic artériából, amellett, hogy a thoracoabdominális aorta fennmaradó részét más elemzésre hagyja. Az en face készítmények lehetővé teszik a lipidekkel teli plakkok gyors mennyiségi meghatározását az aortaívben. A minták gondos vizualizálásával a brachiocephalicus artéria betegségterhelése is számszerűsíthető. Az aorta gyökér időigényesebb keresztmetszete több szakaszt hagy a plakk összetételének részletes értékeléséhez.
Jegyzőkönyv
Minden állatkísérlethez az etikai hatóságok jóváhagyása szükséges.
1. Egéráldozat és aorta mikrodisszekció
2. Az aorta artéria és a brachiocephalic artéria arcelemzése
3. Az aorta gyökér kriozekciója
4. Olajvörös O festés és az ateroszklerózis mennyiségi meghatározása aorta gyökerekben
Reprezentatív eredmények
Az Oil Red O zsírban oldódó, élénkpiros diszazo festék, amely semleges lipideket színez. A sejtmembránokban lévő poláros lipidek nem festődnek. Olajvörös O festést végezhetünk friss, fagyasztott vagy formalinnal fixált mintákon, de nem paraffinba ágyazott mintákon, mivel a lipidek eltávolítása a szükséges viaszmentesítési folyamat során megtörténik. A léziós lipid felhalmozódás számszerűsítését a teljes lézióterület olajvörös O-pozitív területének színduzzadásával lehet elvégezni (4C. Ábra). A hematoxilin egy kék foltot termel a sejtmagokon, ami hasznos a plakk morfológiájának megjelenítésében. A jobb és a bal szívkoszorúér általában az aortától 250 m-re tér el az aorta sinustól 27, ami gyakran egybeesik a legelterjedtebb elváltozásmérettel. Ennek a régiónak a keresztmetszeteit gyakran reprezentatív eredményekként mutatjuk be (4D. Ábra)).
Az olajvörös O felhasználható az arcra készített aorták festésére, de ez a protokoll a Szudán IV-et, egy másik, zsírban oldódó diszazo festéket használja. A Szudán IV a lipidek, trigliceridek és lipoproteinek festésével egyértelműen narancssárga-vörös színben jeleníti meg az ateroszklerotikus plakkokat. A sötét háttér eltávolítása az en face aorta boltívek reprezentatív képein javíthatja a vizuális ábrázolást (5A. Ábra)). Az elváltozás nagysága általában csoportokra oszlik, ami lehetővé teszi a statisztikai tesztelést a tanuló t-tesztjével a csoportok között. A szórásdiagram, amely megmutatja az egyes egereket és a csoportok közötti összehasonlítást, informatív módja az eredmények megtekintésének (5B-C. Ábra). Mivel a csoportokon belüli eltérés általában különbözik az érfa helyzetében, általában külön teljesítményszámításokra van szükség. A szükségtelen eltéréseket a módszertani kompetencia és a protokoll-szabványosítás révén lehet elkerülni. A statisztikailag szignifikáns eredmények megszerzése fontos, de mindig figyelembe kell venni a megfigyelt különbség biológiai jelentőségét.
Kiegészítő 1. ábra: A diák alternatív rendezése az aorta gyökér soros szakaszaihoz. Egyszerűsített, szisztematikus diák szervezése a metszetek összegyűjtésére az aorta gyökérből. A gyűjtemény lehetővé teszi az olaj vörös O festését lipidek és immunhisztokémiai vagy immunfluoreszcens festés céljából. A Picrosirius vörös színű kollagénhez készített speciális tárgylemezeket kihagyják. A fájl letöltéséhez kattintson ide.
Vita
Közzétételek
A szerzőknek nincs mit elárulniuk.
Köszönetnyilvánítás
Köszönetet mondunk Göran K Hansson kísérleti kardiovaszkuláris kutatási egységének minden korábbi tagjának, akik hozzájárultak a protokoll kidolgozásához az elmúlt negyedszázadban. Különösen hálásak vagyunk Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson és Inger Bodin közreműködéséért. Ezt a munkát a Svéd Kutatási Tanács 06816 és a Linnaeus 349-2007-8703 számú, valamint a Svéd Szív és Tüdő Alapítvány, Stockholm Megyei Tanács, Nanna Svartz professzor Alapítvány, a Loo és Hans Osterman támogatásai támogatták. Orvosi Kutatási Alapítvány, a Karolinska Institutet Kutatási Alapítványa és a Geriattrikus Betegségekért Alapítvány a Karolinska Intézetben.