Az élelmiszer-összetevők és azok hatása az autoimmun cukorbetegség patogenezisére emberekben és
TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Táplálkozás-élettani elnök A háztartás- és táplálkozástudományok doktora Elnök: A disszertáció vizsgáztatója: egyetemi-prof. Dr. J. J. Hauner 1. Univ.-Prof. Dr. H. Daniel 2. apl. Prof. Dr. A-G. Ziegler A disszertációt 2010. január 5-én nyújtották be a Müncheni Műszaki Egyetemre, és a Weihenstephan Táplálkozási, Területhasználati és Környezetvédelmi Tudományos Központ 2010. február 25-én elfogadta.
Két nagyapámnak
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék 1 Feladat. 1-3 2 Bevezetés és irodalmi áttekintés. 4-23 2.1 Az 1-es típusú cukorbetegség alapjai. 4 2.1.1 A genetika fontossága. 5-6 2.1.2 Az 1-es típusú cukorbetegség patogenezise és immunológiai háttere. 6-8 2.2 Búza és fehérjefrakciói. 8-9 2.2.1 A lisztérzékenység és az 1. típusú cukorbetegség és a lisztérzékenység közötti összefüggés. 10-14 2.2.2 Búzafehérjék hatása az autoimmun cukorbetegség kialakulására állatmodellekben. 14 2.2.3 Az 1-es típusú cukorbetegség állatmodelljei. 14-15 2.2.4 A táplálkozási tényezők hatása az autoimmun cukorbetegség kialakulására állatmodellekben. 16 2.3 Tehéntej és fehérjefrakciói. 17-18 2.3.1 A tehéntejfehérjék hatása az autoimmun cukorbetegség kialakulására állatmodellekben. 18-19 2.4 A búza és a tehéntej hatása az 1. típusú cukorbetegségben. 19-21 2.5 A bélhez kapcsolódó immunrendszer és az autoimmun diabetes közötti összefüggés. 21-22 2.6 Egyéb élelmiszer-összetevők és lehetséges összefüggésük az 1-es típusú cukorbetegséggel. 22-23 3 Anyag és módszerek. 24-41 3.1 Vizsgálatok a NOD egérmodellről. 24 3.1.1 Egércsoport. 24 3.1.2 Diéták. 24-27 3.1.3. Protokoll 1. és 1a. Részkísérlet. 27-29 3.1.4 Protokoll részkísérlet 2. 29-30 3.1.5 Protokoll részkísérlet 3. 31 I.
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék. Ábrák felsorolása. Asztalok listája. Rövidítések listája. I-V VI-VIII IX-X XI Korábbi publikációk. XII önéletrajz. XIII-XIV hálaadás. XV V
Az ábrák felsorolása 26. ábra Az IAA kötődése a tejhez, tejfehérjékhez, tápszerekhez és búzához az emberi inzulinhoz képest. 74 27. ábra Az IAA kötési görbéi az élelmiszer-alkotórészekkel 75. ábra 28. Az IAA-görbék kötése a tejfehérjékhez. 76 29. ábra Az IAA kötése a különféle tejfehérjékhez az inzulinhoz képest (1. rész). 77 30. ábra Az IAA kötése a különféle tejfehérjékhez az inzulinhoz képest (2. rész). 78 31. ábra Az IAA kötése a különféle tejfehérjékhez az inzulinhoz képest (3. rész). 79 VIII
Táblázatok felsorolása 20. táblázat: Az extrahált élelmiszer-oldatok különböző hígítású fehérjekoncentrációjának és az eredményül kapott átlagértékek elemzése. 66-67. 21. táblázat. Azon vizsgálati személyek jellemzői, akiknek IAA kötődik a tejpor kivonathoz. 73 X
Rövidítések listája Rövidítések listája Ábra. Ábra AK antitest Asp aszparagin cpm radioaktív bomlások percenként (szám percenként) GAD (A) (antitestek) glutamát dekarboxiláz HLA hisztokompatibilitási komplex (humán leukocita antigén) I (A) A Inzulin (auto) antitest IA-2 (A) ) (Antitestek) fehérje tirozin-foszfatáz IA-2 ICA szigetsejt antitestek Ig immunglobulin MHC fő hisztokomabilitási komplex min. Perc nb nem ismert NOD nonobese diabéteszes RBA radioligand kötési vizsgálat fordulat/perc fordulat percenként T1D 1 típusú cukorbetegség Tab. TBST Tris pufferolt sóoldat plusz Tween TBT Tris pufferelt Tween t-tg szövet-tranglutamináz vs. 8 XI
Olyan feladatok meghatározása, amelyek az IAA potenciális kezdeti célantigénjeinek tekinthetők. Összességében ennek a munkának ki kell dolgoznia az egyes élelmiszer-összetevők lehetséges hatását az autoimmun cukorbetegség immunfolyamatára. Az in vivo NOD-modellen kapott adatok felhasználásával a potenciálisan diabetogén élelmiszer-összetevőket humán szérumokkal tesztelik. Ezeknek az in vitro modelleknek a felhasználásával megvizsgálják, hogy az 1-es típusú cukorbetegség immunrendszeri eseményei eredetileg kiválthatók-e az élelmiszer-összetevőkkel való keresztreakciókkal. E kísérletek eredményei leírhatnák a cukorbetegség patogenezisének további, eddig ismeretlen mechanizmusait, és így felhasználhatók az elsődleges terápiák kifejlesztésére az 1-es típusú cukorbetegség kialakulásának megelőzésére a korai gyermekkorban. 3
Anyag és módszerek (D étrend), egy második csoport maradt a búzát tartalmazó A étrenden, egy harmadik csoport pedig a búzamentes B étrenden. nőivarú állatok, akik a C diétán maradtak (lásd 4. ábra). Tenyészpárok Gluténmentes, kazeintartalmú étrend B Glutén- és kazeinmentes étrend C Tesztcsoportok Diéta B n = 12 étrend A n = 12 étrend D n = 12 étrend C n = 9 4. ábra. 1. A B gluténmentes étrend tenyészcsoportjának hím fiatal állatait laktáció után három hetes korban elválasztottuk a gátaktól, a nőstény állatoknál leírtak szerint, és három tesztcsoportra osztottuk. A nőstény egerek csoportos eloszlásához hasonlóan az egyik csoport megkapta a referencia étrendet (D diéta), egy másik a búzát tartalmazó A étrendet kapta és egy harmadik csoport a B búza nélküli étrenden maradt (lásd 4a. Ábra). Tenyészpárok gluténmentes, kazeintartalmú étrend B Tesztcsoportok Diéta B n = 11 Diéta A n = 10 Diéta D n = 12 4a. Ábra A hím NOD egerek allokációja a tenyész- és tesztcsoportokhoz az 1a. Alkísérletben. 28.
Anyag és módszerek A búza fehérjefrakcióinak egymástól való elválasztása érdekében módosított háromlépcsős extrakciót hajtottunk végre, amelynek során az extrakció első lépésében az albuminok és a globulinok a felülúszóban voltak, a második extrakciós lépésben a felülúszóban a prolaminok (gliadinok), a Az utolsó lépésben a glutenineket elválasztották (Wilson és Goulding 1991, Mimouni et al. 1998, Nicolas et al. 1998 Idris et al. 2003). Lisztalbuminek és globulinok extrakciós centrifugálása> 2x üledék Gliadine extrakciós centrifugálás> 3x gluteline üledék extrakció (N 2 atmoszféra) Centrifugálás> Az összes felülúszó 2x centrifugálása Csapadéktárolás 18 ° C-on 7. ábra A fehérje extrakciójának és a frakciók búzalisztből történő elválasztásának sémája. 0,1 g kereskedelemben kapható 550 típusú búzalisztet lemérünk, 1 ml Sörensen-puffert (pH 7,35) adunk hozzá, és az elegyet 4 ° C-on 20 percig rázzuk. 4 ° C-on végzett centrifugálás (20 perc, 1000 fordulat/perc, Sorvall RC 5B Superspeed Centrifuga) után a felülúszót eltávolítottuk, és az üledéket ugyanazzal a módszerrel extraháltuk, miután Sorensen puffert adtunk hozzá. A két felülúszót egyesítettük és 4 ° C-on tároltuk a további extrakciós lépések befejezéséig. 33
Anyagok és módszerek Antitest komplexek kicsapódtak. Centrifugálás után 60 μl felépítményt eltávolítottunk és új csőbe helyeztünk. Miután hozzáadtunk 10 μl anti-humán IgA agarózt 40 μl TBT pufferben ezekhez a csövekhez, újra 4 ° C-on inkubáltuk egy órán át rázás közben. Ezt követte a 3.2.5. Szakaszban leírt mosási lépések az összes csövön (Protein-G-Sepharose és IgA-agaróz) és a mérés a y-számlálóban. 3.3. Statisztika A kumulatív cukorbetegség kockázatának és a cukorbetegség gyakoriságának értékelését a NOD modellben túlélési elemzések segítségével végeztük. A log-rank tesztet használtuk a NOD modell különböző csoportjainak összehasonlítására. A csoportok közötti inzulin pontszámok és antitest prevalencia összehasonlítását a NOD modellben a nem-parametrikus Mann-Whitney U teszt alkalmazásával végeztük. A csirke inzulinhoz való relatív IAA-kötődés és az IAA-affinitások közötti összefüggést Spearman-korreláció segítségével határoztuk meg. Az egyes csoportok közötti affinitásokat Mann-Whitney U teszttel hasonlítottuk össze. Minden elemzés során a p