Az in vivo UVR által kiváltott szürkehályog protokoll molekuláris mechanizmusainak jellemzése (lefordítva
Összegzés
A szürkehályog a vakság vezető oka a világon. A nap ultraibolya sugárzása (UV) a szürkehályog kialakulásának fő kockázati tényezője. Kidolgozták az UVR-B által indukált szürkehályog állatmodelljét. Ebben a cikkben a szürkehályog kialakulásának tanulmányozására szolgáló módszereket írjuk le: UV sugárzásnak való kitettség, kvantitatív RT-PCR és immunhisztokémia.
Absztrakt
A szürkehályog a vakság vezető oka a világon. Az Egészségügyi Világszervezet a szürkehályogot a szemlencse elhomályosodásaként határozza meg, amely akadályozza a fény átadását. A szürkehályog egy multifaktoriális betegség, amely magában foglalja a cukorbetegséget, a dohányzást, az ultraibolya sugárzást (UVR), az alkoholt, az ionizáló sugárzást, a szteroidokat és a magas vérnyomást. Erős kísérleti 2-4 és epidemiológiai bizonyítékok vannak az 5.6 szerint az UVR szürkehályogot okoz. Kidolgoztunk egy állatmodellt az UVR B által kiváltott szürkehályogra mind az érzéstelenített 7, mind az anesztetizált állatokban 8.
A szürkehályog-műtét egyetlen gyógymódja, de ez a kezelés nem mindenki számára elérhető. Becslések szerint a szürkehályog megjelenésének 10 évvel történő késleltetése 50% -kal csökkentheti a szürkehályog-műtét szükségességét 9. A szürkehályog megjelenésének késleltetése érdekében meg kell érteni a szürkehályog kialakulásának mechanizmusait és hatékony megelőzési stratégiákat kell alkalmazni. A szürkehályog kialakulásának módszerei közül az apoptózis fontos szerepet játszik a szürkehályog indukciójában emberekben és állatokban 10. A közelmúltban a lencse apoptózisára koncentrálunk, mint a szürkehályog kialakulásának mechanizmusára. 8, 11, 12. Várhatóan az UV-sugárzás apoptotikus útra gyakorolt hatásainak jobb megértése lehetőséget nyújt új szürkehályog megelőzésére szolgáló gyógyszerek felfedezésére.
Ebben a cikkben leírjuk, hogyan lehet a szürkehályogot kísérletileg kiváltani az UVR-B in vivo expozíciójával. További RT-PCR és immunhisztokémia kerül bemutatásra az UVR-B által indukált szürkehályog molekuláris mechanizmusainak tanulmányozásához.
Jegyzőkönyv
A. Az ultraibolya sugárzásnak való kitettség
- 15 perccel az expozíció előtt altasson el egy nőstény Sprague-Dawley patkányt 90 mg/kg ketalár (ketamin) és 10 mg/kg rompun (xilazin) keverékével intraperitoneális injekcióval.
- Helyezze az állatot egy patkánymegtartóba, és húzza meg az ínszalagokat, amíg a patkányt nem mozdítja el 13 törzs szorítása nélkül.
- Cseppentsen 10 mg/ml mydriacilt (tropicamid) a patkány mindkét szemébe a mydriasis kiváltására.
- Helyezze az állatot úgy, hogy az egyik szem egy keskeny UV-sugárral szemben 300 nm-en 10 nm 14-nél teljes szélességben, a maximum felénél legyen, és az ellenoldali szemet fekete fóliával árnyékolja be.
- Állítsa a patkányt egyoldalúan 1 kJ/m 2 UVR-B alatti küszöbértékre 300 nm-en 15 percig 15.
4. Immunhisztokémiai festés
20 perc).
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
A mérések különböző variációs forrásait varianciaanalízissel becsültük meg, és azt találtuk, hogy állatonként három mérést figyelembe véve a mérések varianciája 15% -os nagyságrendű volt. Így a teljes lencseelemzést figyelembe véve nem lehet növelni a pontosságot. Az ortogonális tesztek tisztázták a kaszpáz-3 üzenet statisztikailag szignifikáns különbségét a 120 órás látencia és a rövidebb késleltetési intervallumok között.
Az in vivo UVR expozíció kaszpáz-3 expressziót indukál.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Ez a cikk olyan módszereket ír le, amelyek lehetővé teszik az UVR-B során indukált szürkehályog molekuláris eseményeinek tanulmányozását.
Figyelembe véve, hogy az in vivo UVR által kiváltott szürkehályogra vonatkozó információk többségét albínó Sprague-Dawley patkányokkal végzett kísérletekben kaptuk, 7, 16, 17, 18, 19, úgy döntöttünk, hogy az albínó Sprague-Dawley patkányokat felvesszük jelenlegi tanulmány használható. A patkányok életkora hat hét volt. A nemet nőnek választották, mivel a hímekkel ellentétben a nőstényekben kevesebb az allergén vizelet. Ezen túlmenően az UVR okozta szürkehályog súlyosságában nincs 20 nemi különbség.
Valamennyi állatot az ARVO Statistic of Animal Use in Ophthalmic and Vision Research (Állat-használatra vonatkozó szemészeti és látáskutatási) nyilatkozatának megfelelően tartották és kezelte. Az etikai jóváhagyást az uppsalai állatkísérleti etikai bizottság kapta, C 29/10 protokollszám. A patkányokat kereskedelmi tenyésztőtől vásárolják (Taconic, Dánia).
Sátor "> Keskeny sávú UVR-forrást választottak úgy, hogy az UVR spektrálisan jól meghatározható legyen. A patkány lencséjének UVR-B maximális érzékenysége 300 nm körül van. Az 1 kJ/m 2 dózist a 15. küszöbérték körül választották. 15 perces expozíciós időt választottak a 21. lencse maximális károsodásának kiváltására. Az UV-B-sugárzás és az utólagos expozíció dózisa a kísérleti tervtől függően változhat.
A párosított szervszem statisztikák és etikai formában előnyös az állatok kutatásban történő felhasználásában. A szem egyoldalú expozíciója az egyik oldalt kitettnek, a másik oldal pedig kontrollként használható egy állatban, így a felére csökkenti az állatok számát a párosítatlan szervhez képest.
Ebben a protokollban érzéstelenítést alkalmaztunk az állatok immobilizálásának módszereként. De létezik egy másik alternatíva is, hogy a laboratóriumunkban kifejlesztett patkány-visszatartó 13 alkalmazható az el nem altatott állatok mozgásképtelenné tételére. Az UV-expozíció előtt a patkányokat kondicionálni kell a patkány korlátozón. Ez az eszköz lehetővé teszi az ellenőrzött ismételt expozíciót akkor is, ha mellékhatásai miatt az altatás nem ajánlott. Itt van a patkánymegtartó készülék, amely az altatott állatok elhelyezésére és tartására szolgál.
A patkánymegtartó fából készült, és laboratóriumunkban különböző pozíciókban van. Megtisztítjuk a korlátozásunkat, mielőtt minden állat rátelepedne. Fatömböket, ereszcsatornákat és faházakat dúsítóként használnak a patkányketrecekben. Ezt a dúsítást az uppsalai állatkísérleti etikai bizottság és az Európai Laboratóriumi Állattudományi Egyesületek Szövetsége (FELASA) hagyta jóvá.
A lencsét rövid idő alatt (5-10 perc) BSS-ben kell elkészíteni. Ez a korlátozás lehetővé teszi, hogy az objektív tiszta és átlátszó maradjon.
A lencse RA1 lízispufferbe vezetésének 30 perces ideje elegendő ahhoz, hogy megzavarja a lencse kapszuláját és a kéregét. Az objektív magja kemény marad 30 percen belül. A lencsemagot vagy az organelle-mentes zónát a lencse nem aktív részének tekintjük transzkripciós faktorként. Ezért a magot eltávolítják a mintából a jel/zaj arány-mRNS expresszió növelése érdekében.
Az RNS tisztaságához (DNS nélkül) használt DNS-specifikus primert véletlenszerűen választottuk ki, hogy p53 primerek legyenek. Bármely gyakran előforduló kódolt DNS-szekvencia, különösen az állati genom választható. Mindkét célkitűzést PCR-rel elemeztük 10 állat/expozíció utáni intervallumban, és mindegyik objektum esetében három független méréssel határoztuk meg a kaszpáz-3 RNS-tartalmat.
Az RT-PCR lehetővé teszi az érdeklődő mRNS mérését. A reverz transzkriptáz átalakítja az mRNS-t komplementer DNS-vé, amelyet azután PCR-rel amplifikálnak. A méréseket a standard görbe alkalmazásával számszerűsítettük az intERestből kapott cDNS sorozatban hígított mintáinak amplifikálásával. A standard görbe alkalmazásának előnyei, hogy a standard görbe megbízható módon biztosítja a koncentráció bizonytalanságának kiszámítását, és hogy a standard görbe kvantitatív méréseket nyújt az érdeklődésre számot tartó mRNS-re. Alternatív megoldásként az érdeklődésre számot tartó mRNS relatív tartalmát úgy lehet megbecsülni, hogy összehasonlítjuk a CT-eljárás alkalmazásával a standardizált fluoreszcens jel előállításához szükséges ciklusok számát. A kalibrációs görbe fő hátránya, hogy ennél többet igényel, mint a genomi termékek Ct módszere.
Immunhisztokémiát alkalmaztunk az aktív kaszpáz-3 térbeli eloszlásának tanulmányozásához a lencse hámsejtjeiben.
A szemeket azonnal -70 ° C-ra fagyasztották, hogy a folyamatban lévő biokémia leálljon. A szemeket azután megőrzés céljából ugyanazon a hőmérsékleten tároltuk.
Az immunhisztokémia két általános problémával jár, az elsődleges antitest specifitásával és az antitest nem specifikus kötésével. Az ellenanyagot jól kontrollált forrásból kell beszerezni, garantálva ezzel a specifitást. Ha lehetséges, a szövetet tartalmazó epitópot pozitív kontrollként kell megfesteni. A nem specifikus festés kiküszöbölése Ha lehetséges, az epitópot blokkolni kell a specifikus antitesttel történő negatív kontroll festés előtt. Ezenkívül a nem specifikus festést minimalizálhatjuk az antitest optimális koncentrációjával és a reakcióidővel. Az UVR-nek kitett szövetek és az UVR-nek nem kitett szövetek festésével lehetővé válik az indukált UVR-epitóp, itt a kaszpáz-3 előállítása. A caspapse-3 jelet mutató sejtek számlálásának megkönnyítése érdekében a fluoreszcens mikroszkóp képét digitálisan rögzítettük. A háttérzaj variációinak minimalizálása érdekében minden mikroszkopikus képhez rögzített beállításokat állítottunk be.
A háttér-fluoreszcencia jel intenzitása folyamatos skálán változik. Ezért határértéket kell meghatározni a jelentős festéshez. Az átlagos fluoreszcencia azonban térben változhat a megfigyelt szakaszon belül, ami megnehezíti az abszolút küszöbérték alkalmazását a jelentős szennyezéshez. Ezért a specifikus festés megítélése tapasztalt megfigyelőn alapul, és az abszolút eredmény-specifikus festés a tapasztalt megfigyelő véleményétől függ, de következetes lesz az adott megfigyelő számára. Emiatt csak tapasztalt megfigyelőt alkalmaztak. Annak javítása érdekében, amelyet a kísérleti UV-sugárzásnak a zajhoz viszonyított változó expozíciója okozott, az egyes szakaszok fényképeit háromszor számoltuk.
Amikor csak lehetséges, az immunhisztokémiát Western-blot segítségével kell megerősíteni, hogy ellenőrizzük a várható molekulatömegű epitópok létezését.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.