Az indukálható hem-oxigenáz (HO-1) hatása a mikrocirkulációra a
A Freiburgi Albert Ludwig Egyetem Sebészeti Egyetemi Klinikájának Általános és Visceralis Sebészeti Osztályáról i.br. Az indukálható hemoxigenáz (HO-1) hatása a mikrokeringésre poszt-ischaemiás pancreatitisben I N A U G U R A L - D I S S R R A T I O N az Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. 2006-ban mutatta be Moritz Scholtes, aki Aachenben született
2 dékán: Prof. Dr. med. C. Peters 1. bíráló: PD Dr. med. O. Thomusch 2. bíráló: Prof. Dr. med. B. Bontások A diploma megszerzésének éve: 2007
4 Ezt a munkát dr. med. E. von Dobschütz
5 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS. 7 1.1 AKUT PANCREATITIS. 7 1.2 MIKROKERESKEDÉS. 8 1.3 ISKÉMIA REFERZIÓ. 9 1.4 HEMDEGRADÁCIÓ A HEMOXYGENASE KÖZÖTT. 11 1.4.1 A hem-oxigenáz és termékeinek reakciója. 12 1.4.1.1 Vas. 13 1.4.1.2. CO. 13 1.4.1.3 Biliverdin és bilirubin. 13 1.4.2 HO izoenzimek: szerkezet, eloszlás, szabályozás. 14 2. A TANÁCS CÉLJA. 17 3. ANYAG ÉS MÓDSZEREK. 18 3.1 ELŐZETES MEGJEGYZÉS. 18 3.2 KÍSÉRLETI MODELL. 18 3.2.1. Kísérleti állatok. 18 3.2.2 Előkezelés és gyógyszeres kezelés. 18 3.2.3 Érzéstelenítés és szellőzés. 19 3.2.4 Mikrosebészeti technológia. 20 3.3 VIZSGÁLATI MÓDSZEREK. 23 3.3.1 Makrohemodinamika. 23 3.3.2 Mikrohemodinamika. 23 3.3.2.1 Funkcionális kapilláris sűrűség. 24 3.3.2.2 A fehérvérsejtek és az endothelialis interakció. 25 3.3.3 Laboratóriumi paraméterek. 26 3.3.4 A HO-1 meghatározása. 26 3.3.4.1 A tevékenység igazolása. 27 3.3.4.2 Northern blot elemzés. 29 3.3.4.3 Western blot elemzés. 31 3.4 KÍSÉRLETI JEGYZŐKÖNYV. 32 3.4.1 Tesztcsoportok. 32 3.4.2 Vizsgálati eljárás. 32 3.4.2.1 Ellenőrzési feltételek. 32 3.4.2.2 Ischaemia-reperfúziós pancreatitis. 33 3.4.2.3 Heme-oxigenáz indukciója 1. 34 3.4.2.4 A hem-oxigenáz aktivitásának gátlása. 35 3.5 STATISZTIKA. 35
6 4. EREDMÉNYEK. 36 4.1 MAKROHAEMODINAMIKA. 36 4.2 MIKROHAEMODINAMIKA. 38 4.2.1 Funkcionális kapilláris sűrűség. 38 4.2.2 Leukocita-endothel interakció. 41 4.3 LABORATÓRIUMI PARAMÉTEREK. 44 4.4 HEMOXIGENÁZ-ÉSZLELÉS. 45 4.4.1 A tevékenység igazolása. 45 4.4.2 Northern blot. 46 4.4.3 Western blot. 47 4.5 ÁTTEKINTÉS. 47 5. MEGBESZÉLÉS. 48 5.1 A MÓDSZERTAN MEGVITATÁSA. 48 5.1.1 Kísérleti akut hasnyálmirigy-gyulladás. 48 5.1.2 Mért paraméterek. 51 5.1.2.1 A mikrohemodinamika számszerűsítése. 51 5.1.2.2 A leukocita-endothel interakció számszerűsítése. 53 5.1.2.3 A tevékenység igazolása. 55 5.1.2.4 Northern blot. 56 5.1.2.5 Western blot. 57 5.2 AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE. 58 5.2.1 Az iszkémia és a reperfúzió hatása. 58 5.2.1.1 Makro hemodinamika. 58 5.2.1.2. Mikrohemodinamika. 58 5.2.1.3. A leukocita-endothel interakció. 62 5.2.1.4. A hem-oxigenáz expressziója és aktivitása. 63 5.2.2 A HO-1 hatása. 65 5.2.2.1 Makro hemodinamika. 66 5.2.2.2 Mikrohemodinamika. 66 5.2.2.3. Leukocita-endothelialis kölcsönhatás. 69 5.2.2.4 A hem-oxigenáz expressziója és aktivitása. 71 6. ÖSSZEFOGLALÓ. 72 7. IRODALOMJEGYZÉK. 73 8. ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK FELSOROLÁSA. 92 9. RÖVIDÍTÉSEK FELSOROLÁSA. 95 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS. 96 11. CURRICULUM VITAE. 98
10 Ezek a mechanizmusok mikrocirkulációs rendellenességet eredményeznek, ami viszont a szövetek energiaellátásának csökkenéséhez vezet, és így fenntartja az ördögi kört (1. ábra). Na + -K + - ATPáz Na + -Ca 2+ - Antiport ATP Na + Ca 2+ proteázok XDh O 2 Hyx + XOx Ischaemia Blood-O 2 Reperfúzió O 2 -Radikális permeabilitás Ödéma Trombózis Leukocita alvadás Sejtkárosodás Endothelialis károsodás Enzimek citokinek 1. ábra: Az ischaemia-reperfúziós károsodás ördögi köre: Az ischaemia (fent) folyamatai károsítják a reperfúziós sejteket (az alábbiakban), ami a szövet további hipoxiás károsodásához vezet
17 2. A VIZSGÁLAT CÉLJA Jelen kísérleti vizsgálat célja egy órás ischaemia és két órás reperfúzió hatásának vizsgálata volt a hasnyálmirigy mikrocirkulációjára. Megvizsgálták, hogy a körülmények változnak-e az idők folyamán. Továbbá meg kell határozni, hogy az indukálható ha-oxigenáz (HO-1) exogén indukciója befolyásolja-e ezeket a körülményeket. Különösen a funkcionális kapilláris sűrűséget, mint a táplálkozási ellátás helyzetének paraméterét reperfúzióban, valamint a leukocita-endothel interakciót vizsgálták, mint a korai gyulladásos reakció paraméterét. Ezen paraméterek meghatározásához intravitális epifluoreszcens mikroszkópia módszerét használtuk. A hem-oxigenáz expressziójában és aktivitásában kifejtett hatását molekuláris biológia igazolta. A munka a következő szakaszokra tagolódik: 1. Az ischaemia és a reperfúzió hatása a hasnyálmirigy mikrocirkulációjára anélkül, hogy exogén hatással lenne a ha-oxigenázra.
22 5. ábra: A hasnyálmirigy-artériák edényeinek sematikus lefutása (HOFFMANN 70-től)