Az orvosi rendelőből és a II. Rendelőintézetből - Großhadern
Az orvosi rendelőből és a II. Rendelőintézetből - a Ludwig-Maximilians-Universität München Komm Großhadern igazgatója: Prof. Dr. med. A. L. Gerbes az erős testsúlycsökkentés (étrend vs hüvely gyomor) hatása a gyulladásra és a glükóz anyagcserére 2-es típusú cukorbeteg elhízott betegeknél Értekezés az orvosi doktori fokozat megszerzéséről a müncheni Ludwig Maximilians Egyetem Orvostudományi Karán Katrin Widynski, München, 2015
A Müncheni Egyetem Orvostudományi Karának jóváhagyásával.Riporter: Prof. Dr. med. Klaus G. Parhofer Társelőadó: Priv. Doz. Dr. Maximilian Bielohuby Prof. Dr. Christine Meisinger A PhD munkatársának társfelügyelete: Dr. med. Benedikt Aulinger Dean: Prof. Dr. med. horpadás. Reinhard Hickel szóbeli vizsga napja: 2015. november 19
Írásbeli nyilatkozat Eskü helyett kijelentem, hogy a disszertációt az erős fogyás (étrend vs hüvely gyomor) hatásának témájáról írtam le elhízott, 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek gyulladására és glükóz anyagcseréjére, hogy a megadottakon kívül más segédeszközt nem használtam, és minden megállapítást megtettem amelyeket teljes egészében vagy hozzávetőlegesen az irodalomból vettek át, ilyenként megjelölve és származásuk szerint egyenként azonosítva a forrás megnevezésével. Kijelentem továbbá, hogy az itt bemutatott értekezés ugyanolyan vagy hasonló formában nem került benyújtásra egy másik intézményhez tudományos fokozat megszerzése céljából. Hely, dátum A doktorjelölt aláírása
Tartalomjegyzék Bevezetés. 1 I Elhízás, cukorbetegség és érelmeszesedés. 1 II gyulladás. 1 III Fontos peptidek a cukorbetegség és az érelmeszesedés kialakulásában. 4 IV Terápiás lehetőségek. 8 1 Konzervatív kezelési lehetőségek. 8 2 Sebészeti kezelési lehetőségek. 8 2.1 Korlátozó eljárások. 9 2.2 Korlátozó eljárások felszívódási zavarokkal. 9 2.3 Malabszorptív eljárások korlátozó komponenssel. 9 V Kérdések és célok. 11 B Anyag és módszerek. 12 I anyag. 12 II módszerek. 17 1 Klinikai-kísérleti rész. 17 1.1 A tanulmány megtervezése és a résztvevők. 17 1.2 Eljárás és látogatások. 18 1.3 Ujjú gyomorműtét és étrend. 19 1.3.1 Gyomorhüvely csoport. 19 1.3.2 Diétacsoport. 20 1.4 Hiperglikémiás és hiperinzulinémiás - euglikémiás bilincs. 20 1.4.1 Hiperglikémiás szorító. 21 1.4.2 Hiperinzulinémiás - euglikémiás bilincs zsírszöveti biopsziával. 22 A laboratóriumi kísérlet 2. része. 23 2.1 Elisa és fotometrikus mérési módszer. 23 2.2 Polimeráz láncreakció. 23 2.2.1 RNS-extrakció, beleértve a DNáz-emésztést. 23 2.2.2 Fordított transzkripció - PCR (RT - PCR). 24 2.2.3 Minőségi PCR. 25 2.2.4 kvantitatív valós idejű PCR (qrt-PCR). 26 I.
3 szövettan. 28 4 az eredmények statisztikai értékelése. 28 C eredmények. 29 I A vizsgálatban résztvevők alapadatai. 29 II Energiaellátás és élelmiszer-összetétel. 30 III BMI kialakulása és a derék kerületének változása. 32 IV. Változás az éhomi vércukorszintben, a HbA1c-ben és a gyógyszeres kezelésben. 33 V A bilincsek értékelése az inzulinrezisztencia meghatározásának alapjaként. 36 VI Változás az inzulinérzékenységben. 37 VII A gyulladás paramétereinek változása. 40 VIII Szövettani zsírszövet-elemzés. 51 D Beszélgetés. 53 I Energiabevitel és fogyás. 53 II A glükózanyagcsere javulása. 54 III A gyulladás változása. 56 IV Az NT-ProBNP változása. 59 V Alternatív magyarázatok a glükóz anyagcseréjének javítására. 60 VI A vizsgálat korlátai. 61 E Összegzés. 63 F Rövidítések listája. 68 G Ábrajegyzék. 70 H táblázatok listája. 72 I Irodalomjegyzék. 73 J Köszönetnyilvánítás. 83 II
Alacsony korlátozó komponens, amelyet főleg olyan betegeknél alkalmaznak, akiknek a BMI-je> 50 kg/m 2 (1, 75). Az összes leírt laparoszkópos eljárás esetében a perioperatív mortalitás kevesebb, mint 1%, és a beavatkozás megválasztása több tényezőtől függ (pl. BMI, életkor, társbetegségek) (1). Minden eljárásban közös a szoros posztoperatív ellátás fontossága a tartós fogyás biztosítása és a hiánytünetek megelőzése érdekében (1, 75). 2a. Ábra: Gyomorszalag, amely (1) -ből származik. 2b. Ábra: Hüvelyes gyomor, (1) -ből vett. 3a. Ábra: Roux-en-Y gyomor bypass, átvett (1) ábra 3b. (1) 10-től
Töltési puffer DNS 6x 10 mM Tris (ph 7,6), 0,03% (w/v) bróm-fenol-kék, 0,03% (w/v) xilol-cianol, 60% (v/v) glicerin, 60 mm EDTA PBS 10 x ( ph 7,4) 1,37 M NaCl, 26,8 mm KCl, 81 mm Na 2 HPO 4, PBS 1x (ph 7,4) reagens hígító (ph 7,4) TAE 1x TAE 50x gél agaróz gél (1 14,7 mm KH 2 PO 4 10% (v/v) PBS (10x) 10% (v/v) PBS (10%), 1% (w/v) BSA 2% (v/v) TAE (50x) 2 M Tris, 1 M jégecet, 0,05 M EDTA agaróz LE TAE 1x-ben, etídium-bromid készletek Az alkalmazott készletekhez a szállított oldatokat és puffereket a gyártó protokollja szerint használtuk. RNázmentes DNázkészlet Qiagen, Hilden, Németország RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Németország SuperScript III First-Strand szintézis rendszer Invitrogen, Karlsruhe, Németország Enzim Enzimek alkalmazásakor a gyártó által ajánlott és szállított oldatokat és puffereket használtuk. AmliTaq Gold DNS Polymerase Applied Biosystems, Carlsbad, USA (5U/µl) Deoxiribonukleáz I, Amplification Invitrogen, Karlsruhe, Németország Minőség (1U/µl) Taq DNS polimeráz, rekombináns Invitrogen, Karlsruhe, Németország (5 U/µl) PCR Eurofins MWG Operon, Ebersberg) Alapozó szekvencia (5-3) GAPDH (hm) előre agggctgcttttaactctggt GAPDH (hm) fordított ccccacttgattttggaggga 13
TaqMan gén expressziós vizsgálatok (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) Cél gén (emberi) referencia szekvencia Rendelési szám TNF alfa NM_000594.2 Hs00174128_m1 MCP-1 NM_002982.3 Hs00234140_m1 IL-6 NM_000600.3 Hs00985639_m1 NM11191 FN1 Fibronektin NM_002026.2 Hs00365052_m1 Adiponectin NM_001177800.1 Hs00605917_m1 RBP4 NM_006744.3 Hs00198830_m1 Vaspin (Serpina12) NM_173850.2 Hs005451801_m1, referenciaszám: NM74518 a kórház klinikai kémiájában mérve. Az emberi plazma mintákhoz mindig használt Elisa készleteket használtak. Paraméter Gyártó Rendelési szám TNF-a ultrahangos K + F Quantikine KHC3014 Leptin R&D Quantikine DLE00 MCP-1/CCL2 R&D Quantikine DCP00 Adiponectin R&D Quantikine DRP300 Resistin R&D Quantikine DRSN00 Fibronectin Abcam AB1088448 NTcam K + F Quantikine HS600B 14
2.2.2 Fordított transzkripció - PCR (RT - PCR) Mivel az RNS nem működhet templátként a DNS-polimerázhoz, először át kell írnia cdna-ba (DNS másolat) (reverz transzkripció). Ezt az Invitrogen gyártótól származó SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR segítségével végeztük. A reverz transzkripciót PCR-rel kombináltuk a cdna amplifikálása céljából. Az RNS denaturálásához az 1. megközelítést alkalmaztuk, és a 2. táblázat mutatja. Mivel a biopsziás zsírból izolált RNS-koncentráció nagyon alacsony volt, 8 µl megfelelt a rendelkezésre álló RNS maximális mennyiségének. 5 percig 65 ° C-on végzett inkubálás és 1 percig jégen történő hűtés után a második adagot adtuk hozzá, amelynek összetevőit a 3. táblázat tartalmazza. Ezután elindították az RHRT PCR programot a 4. táblázat szerint. 2. táblázat: Reakcióelegy (egyszerű) RNS denaturációhoz DNáz által emésztett RNS minta 8 µl Random Hexamer Primer 1 µl dntp s (10 mm) 1 µl 10 µl 3. táblázat: Reakcióelegy (egyszerű) cdna szintézis keverékhez 10 x RT puffer 2 µl MgCl 2 (25 mM) 4 µl DTT (0,1 M) 2 µl RNaseOUT 1 µl SuperScript III RT 0,5 µl DEPC kezelt víz 0,5 µl 10 µl 24
4. táblázat: A reverz transzkripció PCR programja PCR termociklerrel. Hőmérséklet Időtartam 25 C 10 perc, 50 ° C 50 perc, 50 perc, Cdna szintézis, 85 C 5 perc, 4 C vég, 2.2.3, kvalitatív PCR, a DNáz emésztésének sikeres transzkripciója A cdna-ban lévő RNS-re kvalitatív PCR-t végeztünk. A humán GAPDH-t (glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) referenciaként határoztuk meg. Az Invitrogen-től származó Taq DNS-polimerázt (rekombináns, 5 U/μl) és a készletben található reagenseket (5. táblázat) használtuk. A PCR programot a PXE 0.2 Thermal Cyclerben (Thermo Electron Corporation) hajtottuk végre, és a 6. táblázatban található. 5. táblázat: Reakciókészlet (egyszerű) standard PCR-hez (kontroll GAPDH) 10x PCR puffer 2 µl dntp keverék (10 mM) 0,4 µl MgCl 2 (50 mM) 0,6 µl primer 1 µl primer rev 1 µl templát cdna 1 µl Taq DNS-polimeráz (5 U/µl) 0,2 µl ddh 2 O 14 µl 20 µl 25