Bevezetés az alkalmazott technikákba; es a biokémiában
Az antitest (Ab) az immunrendszer által termelt fehérje, amely képes kötődni egy adott molekulához, általában egy fehérjéhez, annak antigénjéhez (Ag). Az Ag Ab felismerésének nagyon magas specifitása és az Ag-Ab kölcsönhatás stabilitása azt eredményezte, hogy az immunológiából származó technikákat még olyan kutatásokhoz is kihasználták, amelyeknek semmi köze a kutatáshoz.
Az antitestek az immunglobulin (Ig) család fehérjéi. A testben többféle Ig létezik (IgA, IgG, IgM stb.). Biokémiai alkalmazásokban főleg IgG-t, antitesteket használunk, amelyek két antigénhez képesek kötődni. Sokkal kevésbé használt, de érdekes fejlődési potenciállal rendelkező IgY-t madarak, köztük csirkék termelnek, és megtalálhatók a petékben, így nincs szükség vérmintákra.
Az antitestek szerkezetének mélyebb megvitatásához hivatkozhatunk egy jó immunológiai tankönyvre. Ezen információk D. Wilkinson egyszerű, de viszonylag teljes bemutatása szintén rendelkezésre áll
MÓDSZEREK ÉS KÉSZÜLÉKEK
Manapság az antitesteket általában kereskedelmi beszállítóktól szerzik be. Bizonyos esetekben magának kell előállítania az antitesteket, különösen, ha ritka vagy nemrégiben felfedezett fehérjékkel dolgozik. Először az állatokat immunizálni kell, hogy antitesteket termeljenek a fehérjével szemben, amelyen dolgozol. Poliklonális vagy monoklonális antitestek állíthatók elő. Ebből a nyers készítményből gyakran szükség van az antitest tisztítására.
Az antitestkészítmény minősége vizsgálati vagy azonosítási célokra két fő tényezőtől függ, a specifitástól és az aviditástól (vagy affinitástól). Először is, az antitestnek csak a kívánt fehérjével kell reagálnia, hogy elkerülje a keresztreakciókat más fehérjékkel, amelyek szennyezhetik, ez a specifitás. Másrészt erősen reagálnia kell ezzel a fehérjével, és nagy affinitással kell rendelkeznie iránta, kapzsiság.
Állati immunizálás
Bizonyos fajokat különösen használnak antitestek előállítására: nyulakat, egereket, patkányokat, kecskéket, juhokat és lovakat. Az állat megválasztása különféle szempontok alapján történik. Ha sok antiszérumot kell előállítania, akkor nagyobb állatot választ. a nagy állatok azonban drágábbak (vásárlás, tenyésztés stb.), és gyakran kevésbé könnyű kezelni őket. Viszont, ha olyan állatot akarunk, amely könnyen kezelhető és tenyészhető a laboratóriumban, akkor kisebb fajok felé fordulunk. A kicsi állatokat, például a patkányokat vagy az egereket, könnyen olcsó létesítményekben tartják, és könnyen kezelhetők. Nagy mennyiségű vért azonban nem lehet venni. Ezért gyakran használják a közepes méretű fajokat, például a nyulat. A rendelkezésre álló antigén mennyisége szintén nagyon fontos tényező: minél nagyobb az állat, annál több antigénre van szükség a hasznos immunválasz kiváltásához.
Akárhogy is, fontos olyan állatot választani, amely filogenetikailag a lehető legtávolabb áll attól a fehérjétől, amellyel immunizálni szeretne. Valójában egy fehérje annál inkább antigén, mivel nem hasonlít egy olyan fehérjéhez, amely normálisan jelen van az immunizálni kívánt fajban. Tehát, ha patkányfehérje ellen akarunk antitestet előállítani, akkor gyakran inkább egy lovat vagy egy kecskét, mint egy másik rágcsálót, például egeret immunizálunk. Mint korábban említettük, a nagyállatok használatának eredendõ korlátai mégis egy kevésbé alkalmas fajhoz vezethetnek, amely könnyebben tenyészthetõ és kezelhetõ. Az is nyilvánvaló, hogy egy állatot nem lehet immunizálni egy olyan fehérjével szemben, amely közös a saját fajának állatainál! Az egereket különösen monoklonális antitestek előállítására használják.
Az antigént többféleképpen lehet injektálni, az a fontos, hogy az antigén a lehető leghosszabb ideig a testben maradjon, és apránként a véráramba kerüljön az antitestek termelésének maximalizálása érdekében. A beadás fő módjai a szubkután, intradermális vagy intramuszkuláris injekciók; intravénás és intraperitoneális injekciókat csak különleges esetekben alkalmaznak. Az antigén felszabadulásának lassítása a véráramba és az immunválasz aktiválása érdekében az antigént általában adjuvánsnak nevezett emulzióval kombinálják. A legismertebb kétségtelenül Freund adjuvánsa, amely ásványi olajból áll, emulgeálószer hozzáadásával (hiányos adjuváns) és inaktivált tuberkulózis bacillus részecskékkel (teljes adjuváns). Ez a fajta comlet adjuváns eljárás azonban fájdalmas az állatok számára, és az állatjóléti ügynökségek határozottan nem ajánlják. Más termékeket ritkábban használnak, például timsósókat, metilezett szérum marhahús-albumint stb.
Az immunrendszer viszonylag könnyen termel antitesteket nagy molekulák, például fehérjék és poliszacharidok ellen, ezeket a molekulákat immunogéneknek nevezzük. A kis molekulák (pl. Szteroid hormonok, kis peptidek stb.) Azonban nagyon csekély antigénnel rendelkeznek. Azonban antitestek termelhetők olyan kis molekulák ellen, amelyeket akkor "hapténeknek" neveznek. Mindenekelőtt ezeket a kis molekulákat konjugálni kell vektorokon ("hordozókon"), fehérjéken, például albuminon vagy limpet hemocianinon (egyfajta gerinctelen). Ez a komplex, miután beadták az állatnak, antitestek képződését indukálja a hapten önmagában és a vektor ellen. Miután felszabadítottuk az antitesteket a vektort felismerő hapten ellen, ezek az anti-haptének felhasználhatók. Így állíthatunk elő antitesteket bizonyos hormonok, gyógyszerek vagy kis peptidek ellen.
A kívánt ellenanyagot tartalmazó szérumot antiszérumnak nevezzük. Rendszerint többféle antitestet tartalmaz (körülbelül tíz klonotípust), amelyek ugyanazon antigén több epitópja (determinánsai vagy kötőhelyei) ellen irányulnak, ezt a poliklonális készítményt hívják. Ilyen keverékkel ugyanaz az antigénmolekula egyszerre több különböző antitestet képes megkötni, mindegyik specifikus epitópjához. Technikákat fejlesztettek ki azoknak a limfocitáknak az izolálására és klónozására, amelyek csak egy antitest molekuláris fajt (azaz klónotípust) termelnek, ezeket az antitesteket monoklonálisnak nevezzük. Ezek az antitestek az antigénnek csak egy epitópját ismerik fel.