DIPLOMA TÉZISEK. Újonnan szintetizált tiokarbonsav-származék (MAH4 HCl) biológiai aktivitása tengerimalacok izolált szervein

1 DIPLOMA TÉZIS Újonnan szintetizált tiokarbonsav-származék (MAH4 HCl) biológiai aktivitása a tengerimalacokból izolált szerveken Ao. Univ.-Prof. Dr. Christian Studenik

2 A családomnak és Bernhardnak

3 Köszönetnyilvánítás Először is szeretnék köszönetet mondani Firdes és Mehmet Çetinkaya szüleimnek, Eylem, Eylen, Özden és Murat testvéreimnek, valamint Bernhard vőlegényemnek, akik mögöttem álltak az egész tanulmány alatt. Ao felügyelőmmel. Univ.-Prof. Dr. Szívből köszönöm Christian Studeniknek az értékes ösztönzéseket, valamint a nagy, emberi és hozzáértő támogatást. Szeretnék köszönetet mondani Ao úrnak is. Univ.-Prof. Dr. Thomas Erker és az Orvosi/Gyógyszerészeti Kémia Tanszék munkacsoportja a tesztanyag biztosításáért. Szeretném megköszönni Alma Seydinovic, Milada Avdic és Hamdi Canan barátaimnak az aktív támogatásukat. Velük az AKH könyvtárban való tanulás sokkal szórakoztatóbb volt. Te mindig velem voltál jó és rossz időkben is, és mindig nagyszerű helyed lesz a szívemben. Ezután szeretnék köszönetet mondani honatyáimnak, Mastalnak a szakdolgozat lektorálásában nyújtott nagy támogatásukért.

4 Tartalom 1 Bevezetés A szív hipertónia hidrogén-szulfid célkitűzései Anyag és módszertan Vizsgálati anyag MAH4 HCl oldószer Kísérleti állatok Fiziológiai elektrolit oldatú szervek A jobb pitvarban használt előkészítő anyagokat használták A tüdő artéria papilláris izma (Musculus papillaris) Kis intesztin (Ileum Terminal Descendis) Aorta A kísérleteket végző karbogén Az anyagok hatása az izolált tengerimalac-szervekre Atrium Dexter (jobb pitvar) Musculus papillaris (papilláris izom) Terminal ileum (vékonybél) Aorta ereszkedő tüdőartéria (pulmonalis artéria)

5 3.6.2 A MAH 4HCL hatásmechanizmusának vizsgálata a bélben Glibenklamiddal és nitro-L-argininnel végzett vizsgálatok Adatok és statisztikák értékelése Atrium dexter Musculus papillaris Aorta, Arteria pulmonalis, Terminalis ileum Statisztikai eredmények A MAH 4HCl vizsgálati anyag eredményei Atrium cordis dexter Muscula descendens tüdőartéria végbélnyílás A MAH4 HCl vizsgált anyag hatásmechanizmusának vizsgálata a bélben Az MAH4 HCl és NO-L-arginin kombinációjának hatása a bélre A MAH4 HCl és glibenklamid kombinációjának hatása a bélre Megbeszélés összefoglaló bibliográfia Curriculum Vitae

15 3 Anyag és módszertan 3.1 Vizsgálati anyag A vizsgálandó anyagot az élettudományi karon, az Orvosi/Gyógyszerészeti Kémia Tanszéken tesztelték az Ao. Univ. Prof. Dr. Thomas Erker újonnan szintetizált és a MAH4 HCl tesztelésére rendelkezésre bocsátotta 1. ábra: A MAH4 HCl MG kémiai szerkezete: 297,89 g/mol oktil [2- (dimetilamino) etoxi] metantioát-hidroklorid 10

3.1.2 Oldószer A kísérletek elvégzéséhez az anyagot előzőleg teljesen fel kell oldani egy megfelelő oldószerben. A MAH4 HCl nagyon gyorsan és teljesen a dist-ben volt. Vízben oldódik. A kezdeti súlyt mindig úgy választottuk meg, hogy a teljes kumulatív adagolás után a szervfürdőben 100 µmol/l koncentrációt érjünk el az edényben. A rendelkezésre álló szervfürdők 8 ml-es és 25 ml-esek voltak. Számítás: MG/4/100 = számítás a nagy edényhez MG/12,5/100 = számítás a kis edényhez A 2. táblázat a kiszámított és felhasznált törzsoldatokat mutatja: 2. táblázat: Alapoldatok Anyag Molekulatömeg MAH4 HCl 297,89 g/mol térfogatú szervfürdő a vizsgált anyag kezdeti tömegében (100 μmol/l)/ml szervfürdő 80, 74 A törzsoldatokat negyvenöt percenként hozzáadtuk egy Finn mikropipetta segítségével, és megmértük a hatást. A hozzáadott koncentrációkat az alábbi 3. táblázat mutatja. 3. táblázat: A pipettázási séma ábrázolása Hozzáadott mennyiség Végső koncentráció 3 µl 3 µmol/l 7 µl 10 µmol/l 20 µl 30 µmol/l 70 µl 100 µmol/l 11

21 4. ábra: A szív sematikus ábrázolása (Netter FH 2003) 16

23 nyert 3 cm hosszú darabot. Az izolálást nagyon körültekintően kellett elvégezni, mivel ez sérthette és túlfeszíthette az aortát. Az aortát, mint minden más készítményt, ezután egy Tyrriét tartalmazó Petri-csészébe helyeztük, és két boncoló tűvel rögzítettük a parafa párnán. Meg kellett győződnie arról, hogy nincs-e túlterhelve. A környező szöveteket, zsírt és vért gondosan eltávolítottuk és körülbelül 2 mm hosszú darabokra vágtuk. A hibás és szabálytalan alkatrészeket ártalmatlanították. 6. ábra: Az aorta sematikus ábrázolása (Netter FH 2003) 18

24 3.5 Felhasznált készülékek Két különböző készüléket használtak a kísérletekben. A papilláris izmok vizsgálatát az 1. készülékkel, aorta-, pitvari és bélvizsgálatokat a 2. készülékkel végeztük. A szerveket az erőátalakítókra akasztották fel egy ezüst drótra. Az erőátalakító a mechanikai erőt elektromos jellé alakította és továbbította egy erősítőnek, amely felerősítette az elektromos jelet, és toll segítségével grafikonpapírra rajzolta. A kísérletek összehasonlításához mindig ugyanazon körülmények között kellett dolgozni az oxigénellátás, a hőmérséklet, a pH-érték, a Tyrode előállítása és összetétele szempontjából 1. 1. készülék Az 1. készüléket csak a papilláris izmokkal végzett kísérletekhez használták. Felépítés: A készülék akrilüvegből készült vízfürdőt tartalmaz. Ebbe a vízfürdőbe egy izomkamra nyúlik ki. Van egy állvány is, amelyre az erőátalakító, a finom meghajtó és az orgontartó csatlakozik. A jobb megértés érdekében lásd a 6. ábrát

25 7. ábra: A berendezés vázlata 1 Az izomkamra 25 ml-t tartalmaz, tehát a Tyrode-hoz ugyanazt a térfogatot használtuk. A vizes fürdőt termosztáttal állandóan 35 ° C-ra állítottuk be. Ez fiziológiai körülményeket teremtett. A tápoldatot ehhez az értékhez kellett igazítani, ezért a Tyrode-ot a kísérlet előtt 10 perccel a kamrába helyezték. A készítményt korábban a fejezetben írták le. Az izomkészítményt az erőátalakítóval érintkezésbe hozták az ezüst horoggal egy ezüst drót felett, a papilláris izmot az elektróda és egy plexi korong közé szorították. Ezután a tartót leeresztették az izomkamrába úgy, hogy a minta teljesen a Tyrode-ban állt. A papilláris izmok nem vernek spontán módon, mint az átrium, de stimulálni kell őket. Ezt Accupulser stimulátorral érték el (Isostim 301T modell. WPI, Hamden, CT, USA). A kontrakciót az ezüst-klorid huzalon keresztül továbbították az erőátalakítóhoz, az erősítő felerősítette és továbbította a síkágyas tollhoz. 20

26 8. ábra: A készülék eredeti képe 2. készülék. A 2. készüléket (lásd 8. ábra) használtuk az aortán, a pulmonalis artérián, a terminális ileumon és a jobb pitvarba. A vizes fürdőt 37 ° C-ra hoztuk. Az aorta és a pulmonalis artéria esetében gyűrű alakú mintákat ezüstdrót segítségével közvetlenül az erőátalakítóhoz erősítettünk. A belekben és a pitvarban két ezüst kampó volt korábban két végére erősítve, és ezek szintén az erőátalakítóval voltak összekötve. A 2. készülékben a vizsgálati tárgyakat a Tyrode-tal töltött szervfürdőkbe engedtük. Az orgonafürdőket szintén 37 ° C-ra állítottuk be és elgázosítottuk. Előfeszítést alkalmaztak finom meghajtón keresztül, majd összehúzódást kényszerítettek, és ezeket az összehúzódásokat vagy ezek változását áramjelekké alakították és rögzítették. 21.

27 9. ábra: A 2. berendezés vázlata 22

28 10. ábra: A készülék eredeti képe Erőátalakító Az erőátalakító segítségével a mechanikai változásokat egy úgynevezett Wheatstone hídon keresztül elektromosokká alakítják át, ami lehetővé teszi a mérést. Az erőátalakítóban striák vannak. Amikor a szervek összehúzódási erejében változások történtek, a megnyúlással szembeni ellenállás és az áramlás is arányosan megváltozott. Az izmok összehúzódásának és ellazulásának változásai átadhatók egy síkágyas rögzítőnek (Flatbed Recorder BD 112 modell, a World Precision Instruments (WPI) cégtől, Sarasota, FL, USA) egy erősítőn (Transbridge TM, 4-Channel Transducer Amplifier, World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA) keresztül. Kipp és Zonen). Ez átadja az impulzusokat a grafikonpapírnak. 23.

29 11. ábra: Az erőátalakító vázlata Karbogénnel való ellátás Minden kísérletben a szervek folyamatos ellátására volt szükség a Karbogén gázzal annak érdekében, hogy elegendő oxigénellátást, a hatóanyag egyenletes keverékét biztosítsák és a ph értéket állandóan tartsák. Ezt az egyes szervfürdőkhöz csatlakoztatott tömlőrendszer tette lehetővé. Az üvegdarabok közvetlenül a fürdők bejárata előtt voltak. Lehetővé tették a finom porlasztást, és a tömlők elején lévő bilincsekkel együtt a levegő optimális adagolását. 12. ábra: A gázellátás eredeti képe 24

33 KCl-ot vettünk fel és oldottunk 100 ml Tyrode-ban. Itt szintén gyors összehúzódás tapasztalható, amely ugyanolyan gyorsan ismét csökkent. Az egyik körülbelül 45 percet várt, amíg stabil platófázis képződött. Az anyagot ismét a pulmonalis artéria (pulmonalis artéria) ismert sémája szerint adtuk hozzá. A kísérlet folyamata megegyezett az aortával, az egyetlen különbség a feszültségben volt, amely mindig 5 mV, azaz 9,81 mn állandó állandó volt, a MAH 4HCL a belekben Vizsgálatok glibenklamiddal és nitro-L-argininnel A beleket a fejezetben leírtak szerint készítettük el, és a 2. készülékhez kapcsoltuk. A kísérlet folyamán lásd az itt fejezetet, ahol az állandó platófázisig vártak, majd az antagonistákat gliebenclamidot vagy nitro-L-arginint adták hozzá, a végső koncentráció a szervfürdőben 100 µmol/l volt. 45 perc elteltével 15 μl törzsoldatot adunk hozzá, és további 45 percig hagyjuk hatni, majd a kísérlet befejeződik. Glibenklamid 13. ábra: Glibenklamid (MW = 494,0 g/mol) 28

36 nulla vonal. Így arányosan összehasonlíthatná az értékeket. Ehhez olyan kalibrációs tényezőt kellett figyelembe venni, amely 1 cm-nél 5 mv-nak vagy 0,98 mn-nek felelt meg. Ha 2 mv-nél dolgozott, akkor az értéket meg kellett szorozni 0,2-vel, 10 mv-t pedig 2 Statisztikával. Az összehúzódási erő és a löketfrekvencia statisztikai értékeléséhez kiszámolták az átlagértékeket és az átlagértékek standard hibáját (SEM). A statisztikai értékek és az EC50 kiszámításához a Sigma Plot 9.0 programot használtuk. Ez a program elmagyarázza a hatóanyag átlagos effektív koncentrációját mmol/l-ben, amelynél a kontrollérték fele eléri. A hiba valószínűségének megfigyelése érdekében a páros megfigyelésekhez a Student t-tesztet végeztük. A 0,1% alatti értékek (P 0,001) nagyon szignifikánsak, az 5% (P 0,05), 1% (P 0,01) értékek szignifikánsak voltak. Az 5% -nál nagyobb hiba valószínűségű (P> 0,05) értékek nem voltak szignifikáns értékek. 31

38 5. táblázat: A MAH 4HCl vizsgálati eredményei a jobb pitvarban 8,54 1,52 ± 2,60 4 ns, 50 ± 12,50-1,18 ± 5,08 4 ns ± 9,24-15,27 ± 3,87 4 0, ± ± 0 4 0,001 Az 5. táblázat megadja az aritmetikai átlagértékeket (f) ütem/perc és százalékban, valamint azok standard hibáit (SEM) az adott koncentrációhoz. n a próbálkozások száma. 33

39 1. ábra: Az MAH4 HCl koncentráció-hatás görbéje a jobb pitvarban az anyagmennyiség a szervkamrában. Az ütési gyakoriságot% -ban adtuk meg az y tengelyen, a vizsgált anyag koncentrációját pedig az x tengelyen. Az EC50 értéket szaggatott vonalakkal jelöltük, és 49 μmol/l. A pontok az ütemfrekvencia kiszámított átlagértékeit mutatják a megfelelő koncentrációknál, az oszlopok pedig a standard hibáikat. 34

40 15. ábra: A MAH4 HCl kronotrop hatásának eredeti felvétele 12 mp 1 cm = 0,98 mn A negatív kronotróp hatás kiolvasható az ütések számából. 35

4.1.2 Musculus papillaris Négy tesztet végeztek a papilláris izomra gyakorolt inotrop hatás értékelésére. A kontrollérték 1,58 ± 0,45 mn volt. Az anyag hozzáadása a kontrakciós erő csökkenését eredményezte. 3 µmol/l koncentrációnál ez a csökkenés -15,05 ± 8,34% volt, és egyre nagyobb lett. 100 µmol/l végkoncentrációnál az összehúzódási erő 0,08 ± 0,02 mN, vagy a kontrollérték 94,92 ± 1,58% -a volt. 6. táblázat: A MAH 4HCl hatása a papilláris izomra. 0,43-15,05 ± 8,34 4 0,99 ± 0,36–40,46 ± 5,70 4 0, 57 ± 0,19–65,92 ± 3,05 4 0,08 ± 0,02–94,92 ± 1,58 4 0,001 Ez a táblázat a számtani átlagértékeket (fc) és azok szórását (SEM) mutatja a jelen lévő koncentrációnál, mn és százalékban egyaránt. 36

42 2. ábra: A MAH4 HCl koncentráció-hatás görbéje a papilláris izomra az anyagmennyiség a szervkamrában. A kontrakciós erő% -os csökkenését az y-tengelyre, a vizsgált anyag koncentrációját μmol/l-re az x-tengelyre vezettük be. Az EC50 értéket szaggatott vonalakkal jelöltük, és 15 μmol/l. A pontok a kontrakciós erő kiszámított átlagértékeit mutatják a megfelelő koncentrációknál, a sávok pedig a standard hibáikat. 37

43 16. ábra: A MAH4 HCl 1 cm = 0,98 mn inotrop hatásának eredeti felvétele A kontrakciós erő csökkenése jól látható az amplitúdó hosszában. Az amplitúdó hossza csökken a vizsgált anyag koncentrációjának növekedésével a szervkamrában, ami a vizsgált anyag negatív inotrop hatásán alapul. 38