Drosophila lárva minták előkészítése gázkromatográfia-tömegspektrometria (GC-MS) alapú

Összegzés

Ez a protokoll leírja a Drosophila lárvák előkészítését a GC-MS alapú metabolomikus elemzéshez.

Absztrakt

Bevezetés

A Drosophila Drosophila melanogaster ideális rendszerként jelent meg a köztes anyagcserét szabályozó molekuláris mechanizmusok tanulmányozására. A Drosophila és az emberek között nemcsak a metabolikus utak többsége konzerválódott, hanem a fő tápanyag-érzékelők és növekedésszabályozók, például inzulin, Tor és myc is aktívak az 1, 2 légyben. Ennek eredményeként a Drosophila felhasználható a cukorbetegségtől és az elhízástól kezdve a neurodegenerációig és a rákig terjedő betegségek metabolikus alapjainak feltárására. Ebben a tekintetben a Drosophila lárvafejlődése ideális lehetőséget kínál az aerob glikolízis, vagyis a Warburg-hatás nevű anyagcsere-program tanulmányozására. Mint sok daganat, aerob glikolízist használ a biomassza előállításához szénhidrátokból, így a Drosophila lárvák aktiválják az aerob glikolízist a 3, 4, 5 fejlődés növekedésének elősegítése érdekében. Ezek a hasonlóságok a lárvák és a tumor metabolizmusa között a Drosophilát kulcsmodellnek tekintik annak megértéséhez, hogy az aerob glikolízis hogyan szabályozható in vivo.

Annak ellenére, hogy a légy népszerű modellnek bizonyult az anyagcsere tanulmányozásában, a Drosophila legtöbb tanulmánya olyan módszerekre támaszkodik, amelyeket 3 különböző metabolit, például trehalóz, triglicerid vagy ATP mérésére terveztek. Mivel az egyes metabolitok méréséhez külön protokollra van szükség, a vizsgálati vizsgálatok fárasztóak, költségesek és elfogultak azoknak a vegyületeknek a javára, amelyek kereskedelmi készletekkel mérhetők. Megoldás jelent meg ezekre a korlátozásokra a metabolomika területén, amely hatékonyabb és pártatlanabb módszert kínál a Drosophila metabolizmusának tanulmányozására. Az elemzés-vezérelt vizsgálattal ellentétben egyetlen metabolomikus elemzés egyszerre képes mérni több száz kismolekulájú metabolitot, és átfogóan megérteni a test metabolikus állapotát 6, 7. Ez a technika jelentősen kibővítette a Drosophila metabolikus vizsgálatok körét, és ennek az új területnek a jövőjét képviseli 8 .

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Tojásgyűjtés

2. a lárva minta összegyűjtése

    A lárvák kora a kívánt szakaszig. Ha L3 lárvákat gyűjt, újraszinkronizálja a mintákat az L2 - L3 moltra. Az újraszinkronizálást általában egy korábban leírt módszerrel hajtják végre, amely az elülső sztigmákat használja fontos fejlesztési lépésként 15. Alternatív megoldásként a mi-L3 lárvák szinkronizálhatók egy sgs3 16 riporter gén segítségével .
    Megjegyzés: Ebben a tekintetben mi-L2 lárvákat (

30 mp Ez idő alatt a lárvák a cső aljára süllyednek, de az élesztő szuszpenzióban marad. Miután az összes lárva laza pelletet alkot, 1 ml-es pipetta segítségével távolítsa el a NaCl-oldatot.

  • Ismételje meg a 2.4 és 2.5 lépéseket kétszer, vagy addig, amíg a végső mosóoldat tiszta nem lesz.
    Megjegyzés: Nincs szükség további mosásra, ha a minta túlzott mennyiségű élesztőt tartalmaz.
  • Centrifugáljuk a mintákat 2000 × g sebességgel 1 percig, 4 ° C-on.
  • Távolítson el minden maradék oldatot 200 µL pipettával.
  • Azonnal fagyassza le a mintát folyékony nitrogénben.
    Megjegyzés: A protokoll ebben a lépésben szüneteltethető. A mintákat 3 hónapig -80 ° C-on tárolhatjuk.

    • 3. Vigye a mintákat a gyöngycsövekbe

    4. A minta kivonása

    5. kémiai származékképzés

    6. GC-MS detektálás

    Megjegyzés: A legtöbb esetben a felhasználó ezt a lépést egy központi tömegspektroszkópiai laboratórium segítségével hajtja végre. Ezt a protokollt egy 30 m-es, 5 m-es védőoszloppal rendelkező GC-oszloppal való használatra tervezték.

    1. Véletlenszerű sorrendben állítsa be a minta sorrendjét.
    2. Készítse elő a GC-MS-t.
      1. Állítsa a héliumhordozó gáz áramlási sebességét 1 ml/perc értékre.
      2. Állítsa a bemeneti hőmérsékletet 250 ° C-ra.
      3. A GC programja a következő hőmérsékleti gradiens futtatására:
        1. Kezdeti hőmérséklet 95 ° C-on, 1 perc tartással.
        2. Növelje a hőmérsékletet 110 ° C-ra 40 ° C/perc sebességgel 2 perc tartással.
        3. Növelje 250 ° C-ra 5 ° C/perc rámpán.
        4. Növelje 330 ° C-ra 25 ° C/perc sebességgel, 4 perc utolsó tartással.