Értekezés. a tudományos fokozat megszerzéséhez. Dr. med. az orvosi karon. a lipcsei egyetem tanára
1 Háromdimenziós szívszövet szövettervezése mesenchymális őssejtek felhasználásával, valamint a szövet szövettani vizsgálata integráció és sejtdifferenciálás céljából in vivo patkány modellben Értekezés tudományos fokozat megszerzéséhez Dr. med. a Lipcsei Egyetem Orvostudományi Karán Beküldte: Cathleen Spath Születési ideje, születési helye:, Bad Frankenhausen Kész: Lipcsei Szívközpont Témavezető: Prof. Dr. med. Stefan Dhein állásfoglalás a doktori fokozat odaítéléséről:
2 Tartalomjegyzék Bibliográfiai leírás A rövidítések listája v vi 1 Bevezetés Háttér Alternatív sejttípusok a szívszövet mérésére Az MSC-k jellemzése Az MSC-k plaszticitása Az MSC-k használata a szívregeneratív orvostudományban Az MSC-k kettős szerepe a tumor fejlődésében Kérdések és célok Anyagok Eszközök és segédanyagok Laboratóriumi eszközök Vegyszerek és biokémiai anyagok Vegyszerek állatkísérletekhez Laboratóriumi állatok Sejtek Gyártói információ: cmscs Szövettan vegyi anyagok Elsődleges antitestek Szekunder antitestek FACS jelzett antitestek A táptalaj összetétele Általános megoldások szövettani megoldásokhoz Módszerek MSC használt vonalak Mesenchymális őssejtek izolálása patkány felnőtt csontvelőjéből (smsc) Patkányok érzéstelenítése Patkányok érzéstelenítése A CMS-ek felolvasztása és tenyésztése A két MSC-vonal szubkultúrája Az MSC-k jellemzése Az MSC-k áramlási citometriai mérései a mintákból A minták mérése az áramlási citométeren ii
4 Tartalom 5 Megbeszélés 71 6 Összefoglalás 80 Ábra-lista 82 Táblázatok 84 Irodalomjegyzék 85 Függelékek 99 Autonómia Nyilatkozat 102 Önéletrajz 103 Publikációk 104 Köszönetnyilvánítás 106 iv
6 Rövidítések listája AEC AK Aqua dest. BSA BMC-k BM-MSC BMMNC-k CaCl 2 2 H 2 O CEE CD CH 2 O cmsc cmsc-et CSC 3-amino-9-etil-karbazol antitestek Desztillált víz Szarvasmarha szérum albumin csontvelő sejtek (nem frakcionált csontvelő sejtek) csontvelő mononukleáris eredetű őssejtek sejtek (a csontvelő mononukleáris sejtjei) kalcium-klorid-dihidrát csirke embrió kivonat differenciálódási klaszter formaldehid kereskedelemben megszerzett mesenchymális őssejtek patkány csontvelőjéből CX40 Connexin 40 Cx43 szív őssejtekből Cx40 Connexin 40 Cx43 Connexin 43 Cx45 Connexin 45 DAPI DMSO ETA EGF FKS FSC GJIC HCl HE 4,6-diamino-2-fenilindol-dimetil-szulfoxid etilén-diamin-tetraacetát endoteliális növekedési faktor Engineered Heart Tissue Extracelluláris mátrix fluoreszcenciával aktivált sejtpásztázás (áramlási citométer) Fluoreszcein-izotiocianát-fibroblaszt növekedési faktor magzati vese közti szérum sertés sertés hidroklorid sav -Eosin vi
7 Rövidítések listája Az IPS sejtek indukálta pluripotens őssejtek HPF nagy teljesítményű mező (1 HPF = 0,1734 mm 2) HS IgG KCl Kg KG KH 2 PO 4 lószérum Immunglobulin G Kálium-klorid Kilogramm testtömeg Kálium-dihidrogén-foszfát Klf4 Kruppel-szerű faktor 4 MgCl 2 6 H 2 O MSC MSC-ET NaCl NaH 2 PO 4 2 H 2 O NaOH Na 2 HPO 4 2 H 2 O Magnézium-klorid-hexahidrát mesenchymális őssejtek Mesenchymal őssejtekből készített szövet et penicillin/sztreptomicin-foszfát-pufferolt sóoldat szobahőmérsékleten a patkány csontvelőjéből származó átlagos önállóan izolált mesenchymális őssejtek standard hibája Műszaki szövet az smsc Sox-2 nemét meghatározó Y régióból (SRY) -box 2 SSC TBS TGFβ TRIS TRITC rpm VEGF vwf oldal trisz pufferolt sóoldatot transzformáló növekedési faktor béta Tris (hidroxi-metil) -amino-metán tetrametil-rodamin-izo-tiocianát U fordulat percenként vaszkuláris endoteliális növekedési faktor Von Willebrand faktor vii
16 2 Anyagok 2.1 Eszközök és segédeszközök Eszközök/segédanyagok Típus Gyártó Ország/Város Szívóeszköz Sejtkultúra/mikrobiológia NeoLab Heidelberg DE/Heidelberg autokláv Varioklav 75T HP Medizintechnik GmbH DE/Oberschleißheim hasi törülköző cm NOBA Verbandmittel Danz GmbH & Co. KG Ventilator ADS 1000 Engler Engineering Corporation Bottle Felső szűrő inkubátor műtéti egyszer használatos szikék Nalgene FastCap palackos szűrőegység, típusú BB 16 & 16CU Sigma Aldrich és Chemie GmbH Heraeus Instruments GmbH DE/Wetter US/Hialeah DE/Steinheim DE/Gera BB513, BB511 Aesculap DE/Tuttlingen Nyomáskalibráló készülék 367 HSE Products NO/Egersund beágyazógép Eldobható sebészeti kendő Tissue Tek Vip E150/E cm Rancodrope Sakura Finetek Europe BV Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG NL/Alphen aan den Rijn DE/Neuwied Eldobható Borotvák Med Compfort AMPri GmbH DE/Stelle Eismaschine 2BE Ziegra-Eismaschinen DE/Isernhagen Házon belül gyártott Orvosi technika Heart Center Leipzig II BD DE/Heidelberg Faden selyemfonott SMI BE/St. Vith Waage mikrobalancia Sartorius BP210D DE/göttingeni kamera PowerShot G5 Canon GB/Middlesex gázáramlásmérő M-45 Stöckert Instrumente DE/München 9
19 2 Anyagok Eszközök/Segédanyagok Típus Gyártó Ország/Város Hőfürdő szövettan típusa 24900 Medax Nagel GmbH DE/Kiel Hőszekrény M400 Memmert GmbH & Co. KG DE/Schwabach Q-Gard2 EMD Millipore Corporation US/Billerica Cell Culture Bank Type HS12 Heraeus Instruments GmbH DE/Gera Centrifuga Megafuge 1.0 R Heraeus Instruments GmbH DE/Gera 2.1. Táblázat: Eszközök és erőforrások. 2.2 Laboratóriumi edények Laboratóriumi eszközök Típus Gyártó Ország/Város Autoklávozó szalag Steri Clin VP-Group DE/Feuchtwangen Fedőlapok mm, mm Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe EHT penész saját készítésű Glasbläserei Kind DE/Lipcsei beágyazó penész Tissue Tek III Sakura Finetek Europe B.V. Beágyazó kazetták K115.1 Carl Roth GmbH & Co. KG Eppendorf csövek 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Greiner-Bio-One GmbH NL/Alphen aan den Rijn DE/Karlsruhe DE/Frickenhausen Erlenmeyer lombik 2 l Simax US/Elk Grove Village vízkezelő rendszer FACS - kerek aljú csövek/BD DE/Heidelberg FACS Flow 20 l, BD DE/Heidelberg Falcontubes 15 ml, 50 ml Greiner Bio-One GmbH DE/Frickenhausen Fettstick Dako Pen Dako GmbH DE/Hamburg páratartalom kamra Wolfgang Weckert Labortechnik DE/Kitzingen szűrő 100 µm 2 BD DE/Heidelberg szűrőpohár üveg Tissue Tek II SA ml, 500 ml, 1000 ml Vogel GmbH & Co. KG Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Gießen DE/Karlsruhe 12
21 2 Anyagok Laboratóriumi eszközök Típus Gyártó Ország/Város Szerológiai pipetta hegyek Fecskendők Mérőtálak 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml 2 ml, 5 ml, 100 ml, 25 ml mm, mm TPP BD Carl Roth GmbH & Co. KG Sejtkultúra lombikok 75 cm 2 Greiner Bio-One GmbH USA/St. Louis DE/Heidelberg DE/Karlsruhe DE/Frickenhausen 2.2. Táblázat: Laboratóriumi edények. 2.3 Vegyszerek és biokémiai anyagok Általános vegyszerek Típus Gyártó Ország/Város Etanol denaturált, 99,8% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe HCl 37% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Izopropanol Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe KCl Merck KGaA DE/Darmstadt NaCl> 99,5% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe NaOH> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe metanol> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe TRIS> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe 2.3. Táblázat: Általános vegyi anyagok. Vegyszerek sejttenyésztéshez Típus Gyártó Ország/Város Aqua dest. BSA glükóz-monohidrát D + Milli Q Academic System Millipore GmbH Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Schwalbach DE/Steinheim mikrobiológiai célokra Merck KGaA DE/Darmstadt CaCl 2 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe 14
22 2 Anyagok Sejtkultúrához használt vegyszerek Típus Gyártó Ország/Város HEPES> 99,5% Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Steinheim KH 2 PO 4> 99,5% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe MgCl 2 6 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Na 2 HPO 4 2 H 2 O Merck KGaA DE/Darmstadt NaH 2 PO 4 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe szilikon ragasztó Dow Corning 734 Dow Corning Corporation USA/Midland szilikon ragasztó steril Medtronic World US/Minneapolis Trypan Blue 0,4% Life Technologies GmbH/Gibco DE/Darmstadt 2.4. Táblázat: Vegyszerek a sejttenyésztéshez. Táptalaj és EHT komponensek Típus Gyártó Ország/Város Adipogenisis differenciálókészlet Csirke embrió kivonat Matrigel (extracelluláris mátrix) Magzati borjúszérum (FCS) A Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt Frozen CE-650-J Sera Laboratories International BD, Merck KGaA/Biochrom GB/Cuckfield DE/Heidelberg DE/Berlin lószérum Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt Kollagen I. típusú patkány farka Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Steinheim II típusú kollagénáz Merck KGaA/Biochrom DE/Berlin M199 1-szeres Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt M199 kétszeres Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt penicillin/sztreptomicin 5000 NE/ml penicillin, 5000 µg/ml sztreptomicin Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt 2.5. Táblázat: Táptalaj és EHT komponensek. 15-én