Fehérje tisztítás nélküli kötési affinitás-meghatározás mikroszkálás termoforézissel

Összegzés

A mikroszkálás termoforézist (MST) széles körben alkalmazhatjuk a kötési affinitás meghatározására anélkül, hogy a célfehérjét sejtlizátumokból tisztítanánk. A protokoll magában foglalja a GFP-kondenzált fehérje túlzott expresszióját, a sejtek lízisét nem denaturáló körülmények között és a HNR-jelek detektálását a ligandum változó koncentrációinak jelenlétében.

Absztrakt

A fehérje kölcsönhatások mennyiségi jellemzése gyakorlatilag az élettudományok minden területén elengedhetetlen, különös tekintettel a gyógyszerek felfedezésére. A K D meghatározásának jelenleg rendelkezésre álló módszereinek nagy része hozzáférést igényel a kívánt fehérjéhez, amelynek előállítása időigényes és költséges tisztítani. Kidolgoztunk egy protokollt, amely lehetővé teszi a kötési affinitás meghatározását mikroszkopikus termoforézissel (MST) anélkül, hogy a célfehérjét megtisztítanánk a sejtlizátumokból. A módszer magában foglalja a GFP-kondenzált fehérje túlzott expresszióját és a sejtek lízisét nem denaturáló körülmények között. A HEK293 sejtekben átmenetileg expresszált STAT3-GFP módszerének alkalmazása lehetővé tette, hogy először meghatározzuk a jól tanulmányozott transzkripciós faktor affinitását különböző szekvenciájú oligonukleotidokhoz. A protokoll egyszerű, és sokféle alkalmazási lehet a kis molekulákkal, peptidekkel, DNS-sel, RNS-sel és fehérjékkel való kölcsönhatások tanulmányozására.

Bevezetés

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Sejt-lizátum előállítása

Ez a protokoll a fúziós GFP fehérjét expresszáló tapadó sejtek számára készült. A szükséges sejtek száma minimum 106-tól 20 x 106-ig terjedhet, a fehérje expresszió szintjétől függően. Például a GEKP-STAT3 túlexpresszáló HEK sejtlizátumot úgy állítottuk elő, hogy 10 T75 lombikban tenyésztett sejteket közel 70% -os összefolyásig 1 ml lízispufferrel kezeltünk. Ezt a lizátumot azonban 150-szer hígítani kellett, hogy optimális szintű fluoreszcenciát biztosítsunk az MST-kísérlethez. A sejtlízis protokollja nagymértékben függ a vizsgált fehérje tulajdonságaitól és intracelluláris lokalizációjától. Ha a detergensek használata a fehérje instabilitása miatt nem kívánatos, az alábbiakban ismertetett ultrahang lehet a legjobb választás. Különböző adalékokat adhatunk a lízispufferhez, hogy megakadályozzuk a fehérje módosulási reakcióit: az EDTA megakadályozza a foszforilációt, a nátrium-vanadát gátolja a tirozin fehérje foszfatázokat, így a nátrium-fluorid a Ser/Thr foszfatázok gátlója.

2. MST puffer kiválasztása és elkészítése

  1. Mivel a fehérje-ligandum kölcsönhatások a pufferelési körülményektől függenek, az MST puffer összetételét egy adott rendszer tulajdonságai alapján választják meg. Általában előnyös legalább két különböző tampont tesztelni.
  2. Készítsen elő 2 MST 5x puffert. Jó tapasztalataink voltak ezzel a két összetétellel: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0,25% NP-40) és Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl; 50) mM MgCl2, 0,05% Tween-20). A BSA hozzáadása (5% a végső kötőanyag-keverékben) segíthet megakadályozni a fehérje tapadását a műanyag csövekben és az üvegkapillárisokban. NaN3 (0,5 mM) szintén várhatóan megakadályozza a mikroorganizmusok szaporodását.

3. Az optimális lizátumhígítás meghatározása

  1. Válassza ki az MST műszeren a λ = 470 nm hullámhosszú LED gerjesztési forrást.
  2. Töltse be a kapillárisokat 2x és 10x hígított ECST-kivonattal MST-pufferrel.
  3. Hajtsa végre a "Kapillárisok keresése" műveletet az MST műszervezérlő szoftveren. Az optimális fluoreszcencia tartomány a hígított lizátumban 400-1500 fluoreszcencia egység.

4. Az optimális ligandum koncentrációtartomány meghatározása

  1. A ligandum legnagyobb koncentrációjának legalább 20-szor nagyobbnak kell lennie, mint a várható disszociációs állandó.
  2. Az alacsonyabb ligandumkoncentrációnak alacsonyabbnak kell lennie, mint a fluoreszcens fehérje moláris koncentrációja.

A ligandumkoncentráció-tartomány becsléséhez lásd a NanoTemper Concentration Technologies keresőeszközt.

5. Sejt-lizátum előállítása és ligandumok hígítása

  1. Helyezzen jégre egy csőtartót a szükséges számú (általában 10–16) 0,5 ml LoBind centrifuga csővel. Pipettázzon 25 µl MST puffert minden cső aljára. Adjunk hozzá 25 µl ligandum törzsoldatot az első kádhoz (1. számú, nagyobb koncentrációjú ligandum), és a többi cső felhasználásával kétszer végezzük el a ligandum hígítást. Tartsa a racket ligand mintákkal jégen.
  2. jégen lassan olvasztják fel a sejtlizátumot.
  3. Hígítsuk a sejtlizátumot MST pufferrel, hogy biztosítsuk a kötési reakciókban a fluoreszcens célfehérje optimális szintjét. A végső fehérjekoncentrációnak az előre jelzett K D közelében kell lennie, vagy kevesebbnek kell lennie. Be kell állítani, hogy a végső oldatban megkapja a szükséges számú fluoreszcenciát. A lizátum GFP-STAT3 koncentrációjának meghatározásához a készüléket fluoreszcein segítségével kalibráltuk. A lizátumban a GFP moláris koncentrációját a fluoreszcein és az EGFP kvantumhozamának, 0,85 és 0,61 arányának alkalmazásával határoztuk meg.