Felhajtóerő-alapú módszer a zsírszint meghatározására a Drosophila Protokollban (németre fordítva)
Összegzés
Itt bemutatunk egy módszert az organizmus zsírszintjének mérésére a Drosophila melanogaster harmadik lárva instar (L3) lárva instarjában. Ez az eljárás a zsírszövet viszonylag alacsony sűrűségét alkalmazza a megváltozott zsírraktárral rendelkező lárvák megkülönböztetésére. A felhajtóerő-alapú elemzés értékes eszköz a gyors, megismételhető és gazdaságos szűréshez.
Bevezetés
Az eljárás a következõképpen következik be, felhasználva a zsírszövet és a sovány szövet sûrûségének különbségét. Az emlősök zsírszövetének sűrűsége körülbelül 0,9 g/ml 14, míg a vázizmok sűrűsége 1,06 g/ml 15. Ez a különbség azt jelenti, hogy a nagyobb zsírtartalmú állatok sűrűsége alacsonyabb, mint az alacsonyabb zsírtartalmú állatoké amelyek lehetővé teszik, hogy jobb szilárd sűrűségű oldatban lebegjenek. Ez a tulajdonság lehetővé teszi nagyszámú állat rendkívül gyors szűrését, ugyanakkor olcsó és nem invazív is. A felhajtóerő-alapú elemzést alkalmazták az ismert zsírszint-szabályozók változó fenotípusainak megerősítésére, valamint az elhízás új genetikai és neurológiai szabályozóinak azonosítására 16,17.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
1. Gyűjtse össze a peték petéjét érdekes genotípusokkal
MEGJEGYZÉS: Az ideális kereszteket 150 szűz legy és legalább 75 hím alkotja. A gyűjteményeken legalább 200 legyet kell tartani.
2. Helyezze át a lárvákat kísérleti ételekhez
- Készítsen kísérleti ételt.
MEGJEGYZÉS: Ez az ételrecept a Bloomington Stock 18. középső receptjén alapul. Fontos változások a megítélés szerint az élesztő mennyiségének növelése az ételek tápértékének optimalizálása érdekében a gyalogos szakasz időzítésével (112–120 óra között a tojásgyűjtés 25 ° C-on). Míg ezt a receptet ideálisnak találtuk kísérleti lárváink egészsége és fejlődése szempontjából, egy étel recept elfogadható pozitív és negatív kontrollokkal végzett kalibrálás mellett, amelyekre példákat mutatunk be a 3.10 lépésben.- Mérjen meg 1600 ml desztillált vizet.
- Keverjünk össze 134 g kukoricalisztet, 10,6 g II típusú agros Drosophila agart és a víz egy részét (
500 ml) 1 literes főzőpohárban. 2 percig keverjük motoros kézi keverővel. Keverjen össze 70 g élő száraz élesztőt, 18,4 g szójalisztet, 84,8 g malátakivonatot és a víz egy részét (
3. Határozza meg a lárvák zsírszintjét
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
1. ábra bemutat egy példát arra, hogy a felhajtóerő-alapú vizsgálat miként képes kimutatni mind a magasabb, mind az alacsonyabb zsírtartalékokat a génmanipulált lárvákban. 1A azt mutatja, hogy az idegsejtek bizonyos alcsoportjának (E347) stimulálása vagy elnémítása a lárvaagyban alacsonyabb és magasabb zsírraktárakat indukál. Mindkét esetben ugyanazt a genetikai háttér-kontrollt alkalmazták. 1B bemutat egy példát arra, hogy ezt a sűrűségvizsgálattal kapott fenotípust hogyan erősíti meg semleges lipid-extrakció és GCMS-sel történő mennyiségi meghatározás.
1. ábra. Az idegműködés a lárva agy bizonyos régióiban szükséges és elegendő a testzsír - szabályozás. A jelzett E347-GAL4 vonal idegi aktivitását elnémította a Shi DN túlzott expressziója vagy aktiválta az NB túlzott expressziója, amint azt a panelek mutatják, és értékelték a testzsírra gyakorolt hatásokat. (A) A lárvák százaléka egyensúlyban úszik különböző sűrűségű oldatokban Ötven lárvát vizsgáltunk biológiai replikációnként, n = 7–9 biológiai replikátumot genotípusonként (B) A testzsír százalékos aránya (teljesen semleges lipidek, ideértve a triacil-glicerideket és a foszfolipideket elosztva a testtömeggel), a GCMS 17,20 (n = 8) értékével mérve. A kék vonalak vagy sávok csak a GAL4-et (UAS-t nem tartalmazó) ábrázoló állatok jelentik a 1118-at a genetikai háttér hatása szempontjából. ellenőrzés alatt tartani. A P-értékek a kétfarkú t-tesztek eredményeit jelentik. **** P 16 megváltozott. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Ennek a technikának további előnye a többiekkel szemben a fokozott érzékenység a népesség zsírszintjének kis változásai iránt. 50 lárva populációban egy teljes koncentrációgradiens futtatásával a populáció zsírértékének enyhe elmozdulása az átlagos koncentráció változásával azonosítható, bár a lárvák koncentrációja lebegni kezd és teljes, nem térhet el a kontrollaktól lebegett. Ez a kicsi populációváltozás nem mindig azonosítható más zsírmennyiség-meghatározási módszerekkel, mivel nagy lárvacsoport elemzését igénylik. A sűrűségvizsgálat másrészt megkérdezi a populáció egyedeit, és következésképpen képes észlelni ezeket a kis változásokat vagy elmozdulásokat a teljes populációeloszlásban.
Mivel ez a technika megbízható eredmények elérése érdekében az oldat sűrűségére támaszkodik, rendkívül fontos, hogy a PBS és a szacharóz oldatokat következetesen készítsék. Megállapítottuk, hogy a különböző PBS-receptek különbségeket okoznak az oldat sűrűségében, és különböző eredményekhez vezetnek. A következetes eredmények érdekében a fent vázolt receptet használjuk. Ezenkívül fontos, hogy 20% szacharózt készítsen ugyanabból az 1x PBS adagból, mivel az oldatsűrűség azonos hátteret eredményez. Ha a két oldatot külön-külön készítjük el, akkor a PBS-ben a sűrűség enyhe változása további sűrűségváltozókat eredményezhet a kísérleti kúpos fiolához való szacharóz hozzáadásán túl. Végül a párolgás problémát jelenthet, mert az idő múlásával, ahogy a víz elpárolog, az oldatok koncentráltabbá válnak. Ezért fontos a palackokat szorosan lezárni és az oldatot minden héten újratervezni, hogy a kísérleti oldatok konzisztensek maradjanak.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.