Felszíni passziválás az egymolekulás fehérjetanulmányok protokolljához (németre fordítva)

Összegzés

Leírunk egy módszert az üvegfelület passziválására polietilénglikol (PEG) alkalmazásával. Ez a protokoll magában foglalja a felület tisztítását, a felület funkcionalizálását és a PEG bevonást. Új stratégiát vezetünk be a felület PEG molekulákkal történő kezelésére két forduló alatt, ami kiváló passziváltságot eredményez a meglévő módszerekhez képest.

Absztrakt

Bevezetés

Egyetlen molekula fehérje vizsgálatának elvégzése során fontos a passziválás magas színvonalának elérése, hogy a kísérletben ne legyenek felszíni indukálta fehérje működési zavarok vagy denaturáció 1,2. Míg az egymolekulájú nukleinsav-vizsgálatokban általában üveg felületet tartalmaznak felületaktív anyagokkal, például szarvasmarha-szérumalbuminnal 3, a passziváció szintje nem elég magas a fehérje-vizsgálatokhoz. A polimerrel (polietilénglikollal, PEG) bevont üvegfelület jobb a 4-6. Ennek során széles körben alkalmazták egymolekulájú fehérje-vizsgálatokhoz, mióta bevezették egymolekulás fluoreszcencia-vizsgálatra, 7/10. A polimer bevonat többféle felületkezelést végez 7, 11, 12. Ezért nehéz az egész eljárást követni részletes utasítások nélkül. Gyakran a felületi passziválás szintje változik attól függően, hogy melyik protokollt követik. Itt bemutatunk egy robusztus protokollt lépésről lépésre, amely eltávolítja az egymolekulás fehérjetanulmányok egyik fő szűk keresztmetszetét. Kérlek hivatkozz 1. ábra áttekintés céljából.

Jegyzőkönyv

1. A tárgylemez előkészítése és tisztítása

A mikrofluid kamra egy kvarclemezből és egy fedőlapból áll. Prismaszerű teljes belső visszaverődés (TIRF) mikroszkópia, a tárgylemez felületét ábrázolják. Ezért fontos, hogy a kvarclemezeket alaposan megtisztítsuk vízzel, acetonnal, KOH-val és piranha-oldattal. A többlépcsős tisztítás eltávolítja a felületen lévő fluoreszkáló szerves molekulákat, amelyek zavarják az egymolekulás fluoreszcencia méréseket. Ezenkívül a piranha rézkarc hidroxilcsoportok létrehozásával hidrofillé teszi a kvarc felületét. A szabad hidroxilcsoportok az amino-szilanizációs reakcióhoz a 3. lépésben vannak.

A mikrofluid kamra egy kvarclemezből és egy fedél ajkából áll. Egy prizma típusú TIRF mikroszkóp használata esetén a fedőüveg felületét nem ábrázolják. Ezért elegendő a fedőlapot csak H 2 O-val és KOH-val tisztítani. Abban az esetben, ha fedőlemezt kell készíteni (pl. A cél típusú TIRF mikroszkóppal), ajánlatos a fedőlemezeket piranha oldattal kezelni (1.7. Lépés). Ne feledje, hogy ha a felső felület PEGilezése nem jó minőségű, az a fehérjék elnyelőjeként működhet, és a fehérje koncentrációjának ingadozását eredményezheti.

  1. Öblítse le H 2 O-val. Helyezze a fedőlapokat (24 x 30, 24 x 40 vagy 24 x 50 mm 2) egy üveg küvettába. Általában 5–15 fedőlapot helyeznek egyetlen edénybe. Öblítse le háromszor a fedőlapokat MilliQ H 2 O-val
  2. Tisztítás KOH-val. Cserélje ki a vizet 1 M KOH-val, és ultrahangolja a fedőlapokat 20 percig vagy tovább.
  3. Öblítse le H 2 O-val. Öblítse le háromszor a fedőlemezeket MilliQ H 2 O-val a KOH nyomainak eltávolításához. Folytassa a 3. lépéssel.

3. A fóliák és a takarópoharak aminoszilálása

A kvarclemezek és a borítólemezek aminocsoporttal történő funkcionális működtetése az amino-szilanizációs kémia segítségével. A metanolt oldószerként, az ecetsavat pedig katalizátorként alkalmazzák az amino-szilanizációs reakcióhoz.

  1. Öblítse le metanollal. Cserélje ki a MilliQ H 2O-t a festőedényekben (az 1. és 2. lépésből) metanollal. A tárgylemezeket és a takarólapokat metanolban tartsuk a 3.3 lépésig. Mivel a metanolban lévő szennyeződések, a fóliák és a borító feleslegesen hosszú ideig (pl. Több órán át) metanolban csúsznak.
  2. Készítsünk amino-szilanizáló oldatot.
    1. Öblítsen egy Pyrex-lombikot többször metanollal. Szondázzuk a lombikokat metanollal 5 percig vagy tovább. Javasoljuk, hogy legyen egy dedikált dugattyúja, amelyet tisztán kell tartani.
    2. Adjunk 100 ml metanolt a lombikba.
    3. 5 ml ecetsavat.
    4. 3 ml APTES-t (3-amino-propil-trimetoxi-szilán) és óvatosan rázzuk össze.
  3. Aminoszilánizálás. Cserélje ki a metanolt a festőlemezeket és fedőlemezeket tartalmazó edényekben az aminosilanizációs reakcióelegyre.
    1. Inkubálás 20-30 percig, inkubálás alatt 1 percig szonikáljuk.
  4. Öblítse le metanollal. Cserélje le az eininosilanizációs reakciót metanollal. Dobja ki a metanolt, és adjon hozzá új metanolos oldatot. Ismételje meg ezt a folyamatot háromszor.

4. Felületi passziválás polimer alkalmazásával (az első forduló)

Passziválja a kvarclemezek és a takarólapok aminnal bevont felületét az NHS-észter-polietilénglikol (PEG) konjugálásával. Ezt a reakciót egy éjszakán át végezzük a PEG-oldat telítettség-koncentrációjával pH = 8,5 mellett.

Tárolja a PEGilált tárgylemezeket és takarólapokat N2-ben -20 ° C-on.

  1. Szárító tárgylemezek és fedőlapok. Óvatosan szedje szét a tárgylemezt és a fedőlapot a fedőlap egyik oldalára mozgatásával, öblítse le MilliQ H 2 O-val, és szárítsa meg N 2-tal.
  2. Diák és fedőlemezek mentése. Azonnali felhasználáshoz kövesse a PEGilezés második fordulójának folyamatát (6. lépés). Hosszabb ideig történő mentéshez kövesse a következő lépéseket.
    1. Helyezzen egy pár tárgylemezt és a fedőlapot egy 50 ml-es csőbe úgy, hogy a PEGilezett felületek egymással szemben legyenek.
    2. Részlegesen csukja be a csövet, porszívózza fel a csövet, és töltse fel N 2-vel. Ezek a lépések elősegítik a PEGilezett terület hosszú ideig történő megőrzését. Csavarja szorosan a tömlőt, és tárolja -20 ° C-on. A fóliák minősége legfeljebb 3 hónapig jó (3. ábra, jobbra).

6. Felületi passziválás polimer alkalmazásával (második forduló)

Újabb PEGilezési fordulat a PEG réteg sűrűbbé tétele érdekében, valamint a felszínen fennmaradó aminocsoportok kioltására. Rövid NHS-észter PEG-molekulák (333 Da) alkalmazása hatékonyan behatol egy meglévő PEG-rétegbe. Javasoljuk, hogy a PEGylation második körét közvetlenül a diavetítés előtt végezze el.

  1. Készítsük el a reakciópuffert. Készítsük el a friss 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-puffert (pH 8,5). A 4.2 lépésben kapott fagyasztott oldat szintén használható.
  2. Készítsünk PEGilációs oldatot. Oldjunk fel 7 μl 250 mM MS4-PEG-t 63 μl nátrium-hidrogén-karbonát-pufferben.
  3. PEGilezés. Kövesse a 4.4 lépésben leírt eljárást. Inkubálás 30 perc és egy éjszakán át.
  4. Szárító tárgylemezek és fedőlapok. Szedje szét a tárgylemezt és a fedőlapot, öblítse le őket MilliQ H 2 O-val, szárítsa meg N 2 -val, és tárolja tiszta pipettadobozban. Mikrofluid kamra összeállításához folytassa a 7. lépéssel.

7. Szereljen össze egy mikrofluid kamrát

Szereljen össze egy mikrofluid kamrát egy pár PEG kvarclemezzel és fedőlappal. A kétoldalas szalagot távtartóként használják. A kamrát epoxival lezárják, és így oldatokat vezetnek be a kvarclemez lyukain.

Újrahasznosított kvarclemezek. A használt fóliákat a fedőlapok és a kétoldalas ragasztószalag eltávolításával újrahasznosítják.

  1. Használat után a kamrák csapvízben tárolódnak. Hosszú távú vízben történő inkubálás megkönnyíti a kamrák szétszerelését.
  2. Forraljuk fel a kamrákat csapvízben mikrohullámú sütővel. Használjon Pyrex főzőpoharat. Főzzük legalább 10 percig.
  3. Vegyük a borítót és a kétoldalas szalagot borotvapengével. A kvarclemezét nem merőleges a síkjára. Ellenkező esetben el fog törni. Tartsa a borotvapengét a csatornán kívül. Ne aggódjon, különben megkarcolja a csatornát.
  4. Öblítse le a tárgylemezeket háztartási mosószerrel, ujjaival dörzsölje őket.
  5. Csúsztasson be egy üveg küvettát. Jellemzően 5–15 tárgylemez adható egyetlen edényben. 10% háztartási mosószerben, és ultrahanggal kezeli a tárgylemezt 20 percig vagy tovább. Öblítse le nagy mennyiségű vízzel ellátott tárgylemezzel.
  6. Folytassák az 1.2 lépéssel.

Reprezentatív eredmények

A mikrofluid kamra elrendezés után (7.1–7.6. Lépés) és a 7.7. Lépés végrehajtása előtt célszerű elvégezni a PEG felület minőségellenőrzését.

Ha a felületi passziválást sikeresen elvégezték, akkor egy képalkotó területre (25 mm x 25 mm) kevesebb, mint 10 nem specifikusan adszorbeált fehérje figyelhető meg, amikor 1-10 nM fluoreszcensen jelölt fehérje (3. ábra, balra) tedd a kamrába.

Ha a tisztítási vagy reakciólépések egyikét nem hajtják végre megfelelően, a nem specifikusan adszorbeált fehérjék száma megnő, és a CCD-képernyő fluoreszcens jelekkel telítődhet. Például, ha a piranha rézkarcot kihagyják, akkor a nem specifikus adszorpció mennyiségének százszorosa van (3a. Ábra, a ... val középen balra összehasonlítani). Ha a második PEGilezési lépést kihagyjuk, körülbelül háromszor nagyobb mennyiségű nem specifikus adszorpció figyelhető meg (3b. Ábra). Alacsony fokú PEGilációt figyeltek meg, amikor a lejárt vegyi anyagok (pl. Az APTES-eket szobahőmérsékleten tárolták több hónapig) (az adatokat nem közöljük). A felület minősége akkor is csökken, ha jelentős idő telt el a PEGilált típus óta (3a. Ábra, lát. Bal Val vel jobb).

Tudomásunk szerint ez az első alkalom, hogy az egymolekulás vizsgálatokhoz bevezetik a PEGilezés két menetét. A PEGilezés két fordulója garantálja a PEG réteg kialakulásának legmagasabb minőségét (3b. Kép). A kettős PEGiláció kiváló típusa jól látható a filmekben (vö. 1a film Val vel Film-1b). Ezekben a filmekben az oldatban megfigyelt fluoreszcens molekulák háttérszignáljait sokkal gyengébbnek használják, mint a kettős PEGiláció, vagyis a fehérjéket ezáltal a kettős PEGilezett réteg taszítja. Bár a kétlépcsős eljárás erősen ajánlott, a második PEGilezési lépést el lehet hagyni, ha a kísérlet elviselhető a nem optimális passziváláshoz.

németre
1. ábra:. Felületkezelési séma (a) egy tárgylemezt megtisztítottunk acetonnal, KOH-val és piranha-oldattal. APEG-sel és PEG-NHS-észterrel funkcionalizált PEG. (B) A fedőlapot KOH-val, és ha szükséges, piranha-oldattal tisztítják. APEG-sel és PEG-NHS-észterrel funkcionalizált PEG.

fig2highres.jpg "width =" 500 "/>2. ábra:. Mikrofluid kamra (a) Egycsatornás kamra. A mikroszkóp tárgylemezébe két lyukat fúrnak. Két kétoldalas szalaggal ellátott fedéllel van felszerelve. (B) Háromcsatornás kamra. A mikroszkóp tárgylemezébe hat lyukat fúrnak. Négy üveg kétoldalas szalaggal ellátott fedéllel van felszerelve.

protokolljához
3. ábra: CCD-képek festékkel jelölt fehérjékkel, oldatban rögzítve. (A) A CCD-képeket prizma típusú teljes belső reflexiós fluoreszcens mikroszkóppal rögzítettük 60x-os objektívvel, 10 nM Cy3-jelző Rep. (Balra) A-felületet a cikkben szereplő protokoll szerint hoztunk létre. (Közép) Az egyik felület elővörös volt a cikkben szereplő protokoll szerint, de a piranha etch kihagyásra került. (Jobbra) Az A-felületet az ebben a cikkben ismertetett eljárásnak megfelelően készítettük el, és 3 hónapig -20 ° C-on tároltuk nitrogén alatt. (B) CCD képeket 10 nM Cy3-jelzővel készített oldattal rögzítettek. (Balra) A-felületet a cikkben szereplő protokoll szerint hoztunk létre. (Jobbra) A-felületet készítettünk a cikkben szereplő protokoll szerint, de a PEGilezés második körét kihagytuk. Méretarány = 5 µm.

1. film: CCD-filmek, festékkel jelölt fehérjék oldattal rögzítve. A CCD filmeket prizma típusú teljes belső reflexiós fluoreszcencia mikroszkóppal rögzítettük 60x objektívvel, 10 nM Cy3-jelzett Rep-vel. Az időfelbontás 100 ms. (A) A cikkben bemutatott protokoll szerint egy felület készült. (B) A-felületet az ebben a cikkben szereplő protokoll szerint készítettünk, de a PEGilezés második körét kihagytuk. Kattintson ide a Film-1a megtekintéséhez, és kattintson ide a Film-1b megtekintéséhez.

Vita

Kritikus lépések ebben a protokollban

Fontos, hogy a felület hidrofil legyen az amino-szilanizációs reakció előtt. Ezt a piranha maratással érték el, amely egy üveg/kvarc felületén hozza létre a szabad hidroxilcsoportokat. Javasoljuk, hogy a piranha maratott felületet hosszú ideig H 2 O-n vagy a levegőn tartsa, mivel a felület hidrofilitása ki van téve és csökken.

Az NHS észter PEG molekulák reaktívak. Javasoljuk, hogy részmennyiségeket készítsen, és nitrogénatmoszférában -20 ° C-on tárolja. A kémiai APTES eltarthatósága szobahőmérsékleten alacsony. Javasolt minden hónapban újat cserélni.

A protokoll módosításai

Ha valamilyen gyakorlati oknál fogva nem használja a piranha-maratást, akkor hosszabb ideig (pl. Egy éjszakán át) marathat a KOH-val, ami szintén hidroxilcsoportoknak lesz kitéve. Ennek az alternatív megközelítésnek a buktatója, hogy a csúszka néhány ismétlés után használhatatlanná válik a súlyos karcolások miatt.

Gyakran üveg/kvarc felületű propán égőt égetnek, amely hatékonyan távolítja el a fluoreszcens szerves anyagokat 7. Ez az eljárás azért került bele a protokollba, mert felesleges piranha maratás. Vegye figyelembe, hogy ez az eljárás a hidroxilcsoportok oxidációját eredményezheti. Ezért ezt az eljárást nem szabad elvégezni, ha egy felületet KOH vagy piranha oldattal marattak.

Ha az egymolekulás képalkotáshoz 7 alatti pH-értékű puffert használunk, a konformáció PEG "gomba" -ról "ecsetre" változik, jelezve a passziválás mértékét. Ezért 7,0 alatti pH-érték alkalmazása esetén ajánlott, hogy a felület diszukcinimidil-észter-tartaráttal 7.

Perspektívák

Ez a munka robusztus protokollt nyújtott a kiváló minőségű felületi passziválás eléréséhez. Ez a protokoll hasznos lehet olyan egymolekulás fluoreszcencia vizsgálatokhoz, amelyekben a 14. és 15. fehérjével immunprecipitált fehérjék, valamint a sejtkivonatokban lévő fehérjekomplexek vesznek részt. Széles körben használják más egyedi molekulák technikáihoz, például erő- és nyomaték-spektroszkópia 16-os spektroszkópiához. Arra is felhasználják, hogy megakadályozzák a sejtek adszorpcióját a 17 felületre.

Az értekezésben szereplő protokoll többlépcsős eljárást igényel. A lipid-PEG-8 és a poli-lizin-PEG-9 felületi passziválása alternatívaként áll rendelkezésre. Mivel ezek nem igényelnek kémiai reakciókat, könnyen kivitelezhető. A passziválás mértéke azonban nem olyan magas, mint egy felület kémiai módosításával.

Közzétételek

Nincs mit elárulnunk.

Köszönetnyilvánítás

Az SDC-t, az ACH-t és a CJ-t az Európai Kutatási Tanács induló támogatásai (ERC StG ​​- 2012-309509) támogatták. J.-MN-t a Nemzeti Kutatási Alapítvány (NRF) (2011-0018198) Korea támogatta; valamint a Koreai NRF által finanszírozott Pioneer Research Center Program (2012-009586), amelyet a Tudományos, IKT és Jövőtervezési Minisztérium (MSIP) finanszírozott. Ezt a munkát az MSIP Koreai Egészségügyi BioNano-Guard Center, mint globális határprojekt (H-GUARD_2013-M3A6B2078947) is támogatta. Az YKL-t és a J.-HH-t a koreai Szöul város szöuli tudományos ösztöndíjas programja támogatta. A jelölt Rep fehérje nagyvonalú ajándék volt Dr. Sua Myong.