HEMBURG-EPPENDORF EGYETEMI KLINIKA - PDF ingyenes letöltés

EGYETEMI KLINIKA HAMBURG-EPPENDORF Kísérleti Orvostudományi Központ Celluláris és Integratív Élettani Intézete Prof. Dr. med. Heimo Ehmke A WNK-kinázok szerepe az elektrolittranszport szabályozásában a BKβ1 knock-out egér disztális nefronjában Disszertáció A hamburgi egyetem orvosi karán fogorvosi doktor fokozat megszerzéséhez Annelen Dittmer, a Buchholz, i.d.n. Hamburg 2013

letöltés

Elfogadta a Hamburgi Egyetem Orvostudományi Karán: 2014. május 13-án Megjelent a Hamburgi Egyetem Orvostudományi Karának engedélyével. Vizsgabizottság, az elnök: Prof. Dr. med. H. Ehmke vizsgabizottság, második bíráló: PD Dr. rer. nat. E. Schwedhelm vizsgabizottság, harmadik bíráló: PD Dr. med. C. Meyer-Schwesinger

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 7 1.1 Artériás hipertónia a nátrium bevitelével kapcsolatban. 7 1.2 Nátrium- és káliumtranszport rendszerek a vesében 9 1.3 Gordon-szindróma: A WNK-kinázok szerepének felfedezése a vérnyomás-szabályozásban. 17 1.4 A WNK kinázok.18 1.5 A WNK kinázok hatása az elektrolit egyensúlyra. 20 1.6 Cél és megközelítés a munkában. 25 2. Anyag és módszerek. 27 2.1 Anyag 27 2.1.1 Általános laboratóriumi felszerelések 27 2.1.2 Fogyóeszközök. 29 2.1.3 Vegyszerek. 30 2.1.4 Enzimek 31 2.1.5 Biokémiai anyagok 32 2.1.6 Kit . 33 2.1.7 Oldatok, pufferek 33 2.2 Módszerek. 36 2.2.1 Az állatok kálium-étrendje. 36 2.2.2 Védelmi intézkedések az RNS izolálására. 37 2.2.3 A vese disszekciója és a vese zóna RNS izolálása. 37 2.2.4 Az izolált vese RNS OD mérése 39 2.2.5 Az izolált vese RNS agilens mérése 39 2.2.6 Mikrodisszekció 40 2.2.7 A nephron tubulusok RNS izolálása. 41 2.2.8 Fordított transzkriptáz (RT) . 42 2.2.9 Aktin-PCR. 43 4

Tartalomjegyzék 2.2.10 Agaróz gél elektroforézis 44 2.2.11 Valós idejű PCR. 44 2.2.12 Statisztika. 49 3. Eredmények 51 3.1 A vad típusú és a BKβ1 knock-out egerek összehasonlítása 51 3.1.1 A kéreg metszet valós idejű PCR elemzésének eredményei . 51 3.1.2 A mikrodisszekció valós idejű PCR elemzésének eredményei 55 3.2 A kálium diéták eredményei. 58 3.2.1 A luminalis nátrium transzporter NCC és az epiteliális nátriumcsatorna ENaCβ kálium diétán 58 3.2.2 Az apikális kálium csatorna ROMK kálium diétán 61 3.2.3 A WNK kinázok kálium diétán 62 3.2.4 Az SGK1 kináz és a GRP58 fehérje kálium diétán. 64 3.2.5 A CHIF fehérje kálium diétán 66 3.2.6 Az NKCC2 transzporter kálium diétán. 67 4. Megbeszélés 68 4.1 A kérdés motiválása 68 4.2 Vad típusú egerek kálium-étrenden ... 69 4.2.1 A nátrium-klorid kotranszporter (NCC) 72 4.2.2 A hám nátriumcsatornája (ENaC). 72 4.2.3 A luminalis káliumcsatorna ROMK 73 4.2.4 A kinázok viselkedése 75 4.2.5 Egyéb lehetséges aldoszteron célpontok 79 4.3 A vad típusú és a BKβ1 knock-out egerek összehasonlítása. 82 4.3.1 A valós idejű PCR eredményei normál étrend mellett 82 4.3.2 A mikrodisszekció eredményei 84 4.4 BKβ1 kiütött egerek kálium diétán ... 85 5

Tartalomjegyzék 4.4.1 Csökkentett kálium diéta a BKβ1 knock-out egerekben. 85 4.4.2 Magas káliumtartalmú étrend a BKβ1 knock-out egerekben. 88 4.5 Kitekintés. 90 5. Összegzés. 93 6. Rövidítések listája. 94 7. Ábrajegyzék. 98 8. Táblázatok felsorolása. 101 9. Irodalomjegyzék. 102 10. Köszönetnyilvánítás. 119 11. önéletrajz. 120 12. Nyilatkozat . 121 6

Anyag és módszerek 2. Anyag és módszerek 2.1 Anyag 2.1.1 Általános laboratóriumi eszközök 1a. Táblázat: Általános laboratóriumi eszközök Készüléktípus megjelölés Vállalati elemzési mérleg ISO 9001 Sartorius AG, Göttingen 3850 ELOK Tuttnauer Systec Ltd., NY, USA Bioanalyzer típusú 2100 Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA Elektroforézis tápegység EPS 600 Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg üveg pipetta pipetta elem Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co KG, Eberstadt elektroforézis kamra Polytron homogenizáló PCR eszköz Tirisztor vezérlő TR50 Génerősítő PCR rendszer 2400 Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, USA Perkim Elmer, Norwalk CT, USA ph-mérő ph-mérő 320 Mettler-Toledo GmbH, Giessen Photometer Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg Pipettes Pipetman P2, P10, P20, P200, P1000 Gilson, Middleton, WI, USA 27.

Anyag és módszerek 1b. Táblázat: Általános laboratóriumi felszerelések Az eszköz típusának megnevezése Vállalat Precíziós mérleg 440-33N Gottl. Kern & Sohn GmbH, Balingen - Frommern valós idejű PCR-eszköz Light Cycler hattyúnyak-fény KL 1500 LCD Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Schott AG, Mainz Speed ​​Vac Concentrator 5301 Eppendorf AG, Hamburg Thermoblock TB1 Biometra GmbH, Göttingen Thermomixer 5436 Eppendorf AG, Hamburg UV-fényasztal - Biometra GmbH, Göttingen Vortexer MS2 Minishaker Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, USA Centrifuga centrifuga 5417C Eppendorf GmbH, Hamburg Centrifuge 5417R Biofuge pico Biofuge stratos Eppendorf GmbH, Hamburg Heraeus Instruments GmbH, Osterode Herae Osterode 28

Anyag és módszerek 2.1.2 Fogyóeszközök 2. táblázat: Felhasznált fogyóeszközök Anyag Termék megnevezés Vállalat Outlet pipetták Szerológiai pipetta 10 ml Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA, 1000 µl Biozym Biotech Trading GmbH, Bécs, Ausztria Mikroreakciós edények 1,5 ml Sarstedt AG, Nümbrecht 2 ml Sarstedt AG, Nümbrecht Valós idejű PCR kapillárisok PCR csövek 0,2 ml Safe-Lock csövek 0,5 ml Agilent Light számára Cycler kapillárisok (20 µl) Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Tubes Cellstar 50 ml Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster, Ausztria Centrifuga csövek 4 ml Sarstedt AG, Nümbrecht 29