Humán CD133 pozitív őssejtek endotheliális differenciálási hatékonyságának optimalizálása -

1 A Hamburg-Eppendorf Egyetemi Orvosi Központ Onkológiai Központjának Orvosi Klinikájáról és Poliklinikájáról II. Az emberi CD133 pozitív őssejtek endotheliális differenciálódási hatékonyságának optimalizálása Értekezés az orvostudomány doktori fokozatának megszerzéséért a Hamburgi Egyetem orvosi tanszékén, Estelle Jiongo, Kamerun Hamburg, 2008

pozitív

2 2 Elfogadta a Hamburgi Egyetem Orvostudományi Karán: Nyomtatva a Hamburgi Egyetem Orvostudományi Karának Vizsgabizottságának jóváhagyásával, az elnök: Vizsgabizottság, 2. lektor: Vizsgabizottság, 3. Lektor: Prof. Dr. W. Fiedler Prof. Dr. H. Kabisch Prof. Dr. N. Kroeger

4 4 H ELISMERÉS I SZÖVETSÉGI NYILATKOZAT J ÁBRÁK LISTA K RÖVIDÍTÉSEK LISTÁJA TÁBLÁZATOK LISTÁJA

23 23 érintett hematopoietikus őssejtek. Erre a célra a sejtek egy részét üvegtartalmú talajra kell kiteríteni. A hematopoietikus őssejtek differenciálódási sebességének növelésének másik lehetősége elérhető a közeg felülúszóiban lévő morfológiailag differenciálatlan sejtek megkülönböztetésével. Arra a kérdésre, hogy a nem tapadó sejtek megkülönböztetik-e az endoteliálisan, válaszolni kell ezeknek a sejteknek a replikálásával. Az endoteliális sejtek további forrásai a CD14 pozitív, monocita őssejtek (Fernandez és mtsai., 2000) és az MNC-k (Murasawa és mtsai., 2002) .Ezeket el kell különíteni a leukáferezistől, a buffy rétegektől és a csontvelőtől. A vizsgálatoknak a kapott endoteliális sejtek mennyiségi meghatározására és immunhisztokémiai jellemzésére kell korlátozódniuk. Mindhárom sejttípust és a frissen izolált hematopoietikus őssejteket differenciálási viselkedésük tekintetében össze kell hasonlítani.

24 24 C Anyag és módszerek 1 Anyag 1.1 Laboratóriumi felszerelés 1. táblázat: Felhasznált laboratóriumi felszerelések Beszerzési forrás Gyártó neve Eszköz márka, Wertheim Neubauer számláló kamra Számláló kamra Eppendorf, Hamburg Referencia 10, 100 és 1000 pipetta Forma Scientific, Marietta (USA) Vízköpenyes inkubátor inkubátor társaság GFL vízfürdő-vízfürdő laboratóriumi technológia, Burgwedel Heraeus Instruments, Hanau Lamin Air HB 2448 Varifuge 3.2 RS steril munkaasztal centrifuga Hirschmann laboratóriumi felszerelés, Pipetus akkumulátor, pipettázó segédanyag Heilbronn Leica, Solms LEICA DM IRB IM50 fluoreszcencia szoftverrel Fordított mikroszkóp Miltenyiio Magneticadells Glothec BergSchild, Frankfurt Cytospin 2 citocentrifuga Zeiss, Jena Axioplan Axiovert 25 Phomi 3 fluoreszcens invertált mikroszkóp invertált mikroszkóp/fluoreszcencia invert mikroszkóp mikroszkóp

25 Fogyóeszközök 2. táblázat: Fogyóeszközök ellátási forrása Becton Dickinson, Franklin Consumables Discardit II steril fecskendők; 5, 10 és 20 ml-es tavak (USA) BD Falcon, Heidelberg Sterile eldobható pipetták; 1, 2, 5, 10 és 25 ml sejttenyésztő üreges lemezek; Multiwell 6, 12, 24 vagy 96 lyukú sejtsziták 40 µm-es centrifuga csövek; 15 és 50 ml Greiner, Frickenhausen Eppendorf, Hamburg Heinz Herenz, Hamburg Millipore, Schwalbach Miltenyi Biotec, Bergisch tubusok: 15 és 50 ml-es edények; 0,5, 1,5 és 2,0 ml Pasteur pipetta 230 mm, üveg Steriflip (eldobható sterilizáló egység) MACS elválasztó oszlopok LS és MS Gladbach Partec, Münster Paul Marienfeld GmbH és 30 µm-es sejtsziták borító poharak Co. KG, Königshofen Lauda slide Sarstedt, Nümbrecht pipetta hegyek (10, 100 és 1000 µl) Schott, Mainz Shandon Inc., Pittsburgh (USA) Üvegáru papírszűrők a Cytospin 2 (vastag szűrőkártyák) VWR International, steril fecskendőszűrők 0,45 és 0,22 µm (steril Dietikon) (Svájc) fecskendő szűrő)

26 Vegyszerek és gyógyászati ​​termékek 3. táblázat: Felhasznált vegyszerek és gyógyászati ​​termékek Beszerzési forrás Baxter, Munich Biochrom AG, Berlin Biotest, Dreieich Vegyi/orvosi termék ACD-A Biocoll Separating Solution (Ficoll) AB-szérum humán szérumalbumin (HSA) Cambrex, New Jersey (USA) EGM-2 golyókészlet Fährhaus Handelsgesellschaft Hamburg Gibco, Karlsruhe Pharma mbh, hidrokortizon (HC) D-PBS magzati borjúszérum (FKS) fungizon (amfotericin B) lószérum (HS) IMDM penicillin-sztreptomicin-glutamin (100x ) Harbour Bio-Products, humán fibronektin (FN) Norwood (USA) JT Baker, Phillipsburg Ethanol Absolute (USA) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach CD133 sejt izoláló készlet, humán CD14 mikro gyöngyök, humán MACS BSA Stock Solution R&D Systems, Minneapolis (USA) rhang-1 (rekombináns humán angiopoietin-1) rhang-2 (rekombináns Humán angiopoietin-2) tripánkék oldat (0,4%) TEBU, Offenbach bfgf (Fibroblast Growth Factor-basic) EGF (epidermális növekedési faktor) Flt-3-ligand (Flt-3-l, Fms-rel kapcsolatos tirozin-kináz 3 ligandum)

27 27 HGF (humán hepatocita növekedési faktor) IGF-1 (inzulinszerű növekedési faktor-I) IL-8 (interleukin-8 vagy monocita eredetű neutrofil kemotaktikus faktor) SCF (őssejt-faktor) SCGF-ß (őssejt-növekedési faktor) -béta) VEGF (vaszkuláris endoteliális növekedési faktor vagy Recombinat Human VEGF165) 1.4 Antitestek az immunfluoreszcencia-elemzéshez 4. táblázat: Felhasznált antitestek Humán jelölés Izotípus Klón Alkalmazási forrás Antigén g CD144 - Egér 55-7H1 Immun- BD Pharmingen, (VE- IgG 1 κ hisztokémia San Diego (USA) Cadherin) FITC vwf (von- Sheep- - Immun- The Binding Site, Willebrand Anti- hisztokémiai Birmingham-factor) Human (UK) IgG Secondary Texas Red Goat- - Immun- Jackson Antitestek Anti-histochemistry ImmunoResearch, CD144 egérhez West Grove IgG (USA) (H + L)

A pufferek és a tápközeg összetétele Az alkalmazott citokinek és koncentrációik 5. táblázat: Az alkalmazott faktorok és koncentrációik áttekintése Tényezők Koncentráció a kapott törzsoldatban (µg/ml) (ng/ml) bfgf 50 1 EGF Flt-3-l HGF IGF IL rhang-1 (Ang-1) rhang-2 (Ang-2) SCF SCGF-ß VEGF koncentrációjú alap tápközeg és pufferek AB-PBS -8 ml PBS -2 ml AB-szérum Erylyse puffer (steril szűrt) -8,29 g NH4Cl (155 mm) -1 g KHCO3 (10 mm) -45,2 mg EDTA (0,1 mM) -1 L H20 EBM ml EGM-2 bazális táptalaj -10 ml FCS -1 ml penicillin/sztreptomicin (Pen/Strep) -100 µl amfotericin B.

29 29 EBM-1-80 ml EGM-2 bazális táptalaj -20 ml FCS -1 ml penicillin/sztreptomicin (Pen/Strep) -100 µl amfotericin B EBM-2-450 ml EGM-2 bazális táptalaj -50 ml FCS -5 ml penicillin/sztreptomicin -2 ml rhfgf-bheparin -500 µl amfotericin B -500 µl GA-1000 (gentamicin) -500 µl aszkorbinsav (AS) -500 µl VEGF -500 µl R3-IGF µl heparin -500 µl rhegf-200 µl tápközeg hidrokort; steril szűrt) -50 ml LBMCM (hosszú távú csontvelő tenyészközeg. Dexter TM; Acta Haematol. 1979; 62 (5-6):) -500 µl SCGF-ß (10 µg/ml) -250 µl VEGF (10 µg/ml) -250 µl Flt3-l (10 µg/ml) fibronektin törzsoldat (a lemezek bevonására): -1 mg fibronektin (FN) -1 ml steril víz -24 ml PBS MACS puffer -475 ml PBS -12,5 ml humán szérumalbumin (HSA) -3 ml aqua-citrát-dextróz A (ACD-A) stop táptalaj (tripszinezés után) endothelsejtekhez: 20% FCS EGM-2 bazális táptalajban vagy szuper táptalajban

30 30 LBMCM -400 ml IMDM -50 ml borjúmagzati szérum (FKS) -50 ml lószérum (HS) -500 µl hidrokortizon (HC) tripszin törzsoldat: -1 ml tripszin -9 ml PBS alap táptalaj, citokinek differenciálódási közegként -LBMCM mint alapközeg 6. táblázat: A hozzáadott citokinek áttekintése Hozzáadott citokinek VEGF VEGF + Ang-2 VEGF + bfgf VEGF + EGF VEGF + HGF VEGF + IGF-1 VEGF + IL-8 VEGF + bfgf + EGF VEGF + bfgf + HGF VEGF + bfgf + IGF-1 VEGF + bfgf + IL-8 VEGF + bfgf + Ang-2 VEGF + bfgf + EGF + HGF + IGF-1 + IL-8 - EBM-1 alapközegként 7. táblázat: A használt áttekintése Tényezők és kombinációk Hozzáadott citokinek VEGF VEGF + Ang-1 VEGF + Ang-2