IgG - ttg - Immunválasz 1-es típusú cukorbetegségben, celiakia esetén - PDF ingyenes letöltés
Egyetemi Kórház Ulmi Belgyógyászati Központ Belgyógyászati Klinika I Orvosi igazgató: Prof. Dr. Guido Adler az endokrinológiára, a cukorbetegségre és az anyagcserére összpontosítva Prof. Dr. med. Bernhard O. Böhm IgG - ttg - immunválasz celiaciás 1-es típusú cukorbetegségben Értekezés a fogorvosi doktori fokozat megszerzéséért az Ulmi Egyetem Orvostudományi Karán Timo Knoche Böblingen 2010 I
Megbízott dékán: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. előadó: Prof. Dr. Bernhard Otto Böhm 2. riporter: Prof. Dr. Kern Peter PhD nap: 2010. április 22., II
Tartalom-jegyzék Rövidítések listája 1. Bevezetés 1 1.1 A lisztérzékenység meghatározása 1 1.2 Előzmények 2 1.3 A lisztérzékenység epidemiológiája és patogenezise 4 1.4 A lisztérzékenység formái 8 1,5 A lisztérzékenység és egyéb betegségek 12 1,6 16. kérdés 16 2. Anyag és módszerek 17 2.1 Reagensek, oldatok és pufferek 17 2,2 eszközök és fogyóeszközök 19 2.3 Betegszérumok 20 2.4 Titer meghatározása 21 2.4.1 A ttg-iga titer meghatározása 21 2.4.2 A ttg-igg titer meghatározása 29 3. Eredmények 30 3.1 A ttg-iga titer meghatározása 30 3.2 A ttg-igg titer meghatározása 32 3.3 A ttg-igg és a ttg-iga titerek közvetlen összehasonlítása 34 3.4 A titerek/statisztikai eredmények számítási összehasonlítása 38 IV
4. Megbeszélés 43 5. Összefoglalás 52 6. Irodalomjegyzék 53 V. melléklet
Rövidítések listája AGIA antitestek a Gliadin APC antigének ellen, amelyek BSA szarvasmarha szérum albumint CD differenciálódási csoportot mutatnak DR, DQ HLA gén lokuszok a 6. kromoszómán DZG Deutsche Zöliakie Gesellschaft e.v. ELISA enzim kapcsolt immunszorbens assay EmA Endomysium Antitestek ESPGHAN Európai Gyermekgasztroenterológiai, Hepatológiai és Táplálkozási Társaság GFD Gluténmentes étrend, Gluténmentes étrend H 2 SO 4 Kénsav HLA Humán leukocita antigének IFN Interferonok IgA Immunoglobulin A típusú IgE Immunoglobulin M típusú G típusú IgM immunglobulin IL Interleukin MHC Fő hisztokompatibilitási komplex ml milliliter MMP mátrix metalloproteinázok mrna messenger Ribonukleinsav PBS foszfát pufferolt sóoldat TGF tumor növekedési faktor TMB tetrametilbenzidin TNF tumor necrose faktor transzglutamin transzgáz szövet transzgát szövet transzgát szövet szövet szövet; önkényes, önkényes egység VI
- Ellenőrző biopszia kétséges klinikai siker esetén gluténmentes étrenddel - Glutén expozíció biopsziával: és a destruktív III típusú 3 a – c altípussal, amely a villusok dús vagy ellaposodását, kriptás hiperpláziát, megnövekedett intraepithelialis limfocitákat és gyulladásos beszűrődést mutat a lamina propriában (DZG 2009). 11.
Az Endomysium antitestek a normál tartományban, valamint a Dudenal biopszia nem feltűnő képet mutatnak. A szelektív IgA-hiányban szenvedő betegeknél tízszer nagyobb a celiakia kialakulásának kockázata. A Sjogren-szindróma, a hajhullás és az Addison-kór további olyan rendellenességek, amelyek a lisztérzékenységhez köthetők. A vékonybélben a limfóma kockázata azoknál a betegeknél a legnagyobb, akiknél felnőttkorban celiaciát diagnosztizálnak. A garat és a nyelőcső rákja szintén gyakrabban fordul elő celiaciás betegeknél. A legfrissebb, 2004-es tanulmányok azonban azt mutatják, hogy csak mérsékelten növekszik a daganatok kockázata, és hogy a szigorú GFD betartása 5-10 éven belül a lakosság kockázatának kiigazítását eredményezi (Mäki and Collin 1997, DZG 2009). 15-én
1.6. Kérdés A szerológiai diagnosztika bevezetésével és az antitestek felfedezésével a prevalencia gyorsan növekedett. Világossá vált, hogy a biopsziával rögzített cöliákiás betegek csak a jéghegy csúcsa. A szöveti tesztek, az endomysium és a retikulin tesztek hátrányai a magas költségek és a majom nyelőcsőből származó szubsztrát korlátozott mennyisége. Ezenkívül speciálisan képzett személyzetre van szükség a tesztek elvégzéséhez, mivel a tesztek technikailag nagyon összetettek. (Mäki és Collin 1997). Az antigén ttg azonosítása után specifikus tesztkészletek állíthatók elő az antitestek kvantitatív kimutatására. Az olyan tesztek, mint az Elisa, nemcsak a kezdeti diagnózist könnyítették meg, hanem az utólagos diagnózist és az ellenőrző diagnózist is. A közös tesztek az antigén ttg-t használják az IgA és IgG antitestek kimutatására. Ez a tézis az IgA és IgG anti-tTG-Ab eloszlására összpontosított az 1-es típusú cukorbetegség összefüggésében. A cél annak ellenőrzése, hogy az eredmények lehetővé teszik-e következtetések levonását az immunológiai folyamatról, és hogy a diagnosztika javul-e ebből. 16.
2. Anyag és módszertan 2.1 Reagensek, oldatok és pufferek Celikey IgG PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Szövet transzglutamináz (humán, rekombináns) IgG antitest teszt in vitro diagnosztikához Humán, rekombináns ttg antigénnel bevont mikrotiter csíkok (17996) 6 ttg ( IgG) antitest standard oldatok 0 3 7 16 40-100 U/ml koncentrációban PBS-ben BSA-val 0,095% (w/v) nátrium-azid 1 pozitív kontroll BSA-val, 0,095% (w/v) nátrium-azid, detergens és humán szérum PBS 1 negatív kontroll BSA-val, 0,095% (w/v) nátrium-azid, detergens és humán szérum PBS mosó pufferkoncentrátumban és detergens, színes sárga IgG konjugátum, anti-humán IgG peroxidáz, színes vörös Enzim szubsztrát TMB (3, 3, 5, 5, tetrametilbenzidin) stop oldat, 0,5 MH 2 SO 4, színtelen 17
Celikey PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Szövet transzglutamináz (humán, rekombináns) IgA antitest teszt in vitro diagnosztikához Mikrotiter csíkok (18196), humán rekombináns ttg antigén 6 ttg (IgA) antitestekkel. Standard oldatok 0-3- 7-16-40-100 U/ml PBS-ben BSA-val 0,095% (w/v) nátrium-azid 1 pozitív kontroll BSA-val, 0,095% (w/v) nátrium-azid, detergens és humán szérum PBS 1-ben negatív kontroll BSA-val, 0,095% (w/v) nátrium-azid, detergens és humán szérum PBS mosópuffer-koncentrátumban 20x PBS-koncentrátum 0,095% (w/v) nátrium-aziddal és detergenssel BSA-val ellátott mintapuffer, 0,095% (w/v) nátrium-azid és detergens, színes sárga IgA konjugátum, Anti-humán IgA peroxidáz, színes vörös enzim szubsztrát TMB (3, 3, 5, 5, tetrametilbenzidin) stop oldat, 0,5 MH 2 SO 4, színtelen 18
2.2 Eszközök és fogyóeszközök Eppendorf Hamburg - Pipetta-referencia - Multipipette Multipette plus - Combitipp 1,0 ml, 2,5 ml, 5,0 ml Sarstedt Nümbrecht - Pipettacsúcsok sárga 10 100 µl - Pipettahegyek kék 100 1000 µl Vortex - Shaker Genie Ampuwa - Desztillált Víz SLT - Spectra mikrotiter lemezmérő Epson - LX-400 nyomtató Egyéb - hagyományos személyi számítógép, MS Word 2003, MS Excel 2003 - Synelisa Software Ver. 1995. július 3.2. - A Winstat és a PASW Statistics statisztikai programok 18 19
2.3 Betegszérumok Olyan betegszérumokat használtunk, amelyekhez IgA-titerek már rendelkezésre álltak. Azokat a szérumokat választottuk ki, amelyek IgA-titere meghaladja a 8 U/ml-t, hogy elkerüljük a határvonal pozitív szérumokat (szürke terület). 803 1-es típusú cukorbetegségből álló populációból 44 női és 26 férfi páciens közül 73 IgA pozitív szérumot választottak ki az IgA és IgG titer meghatározására. A nemet 3 mintában nem lehetett hozzárendelni. A betegek életkora 4 és 84 év között mozog. A betegek közül 25 IgA-titere nagyobb volt, mint 100 U/ml. Ezeknek a betegeknek a szérumát a megfelelő hígításokkal tovább vizsgáltuk az antitest-titerek számszerűsítése érdekében. 1. táblázat: A népesség áttekintése, N = az életkorok száma N Férfi Nő Ismeretlen tartomány 1 59 20 38 1 4 84. vizsgálat 2 14 6 6 2 11 83 20
23 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 2. ábra: Pipettázási séma szabványai: fekete kontrollok: fehér +/- betegek: fehér, számozott
2.4.1.3. A vizsgálati eljárás grafikus ábrázolása = emberi, rekombináns szöveti transzglutamináz antigén szilárd fázisként 3. ábra: A szérumminták 10 pipettázásából álló vázlatos tesztbeállítás = szöveti transzglutamináz antitest, = emberi, rekombináns szöveti transzglutamináz antigén szilárd fázisként = egyéb sejtkomponensek 4. ábra: Vázlatos tesztbeállítás 2/10
= Szöveti transzglutamináz antitest, = emberi, rekombináns szöveti transzglutamináz antigén szilárd fázisban = egyéb sejtkomponensek 1. reakció: A beteg szérumában jelen lévő szöveti transzglutamináz antitestek kötődnek az antigénekhez. 30 percig inkubáljuk. Antitestek, = emberi, rekombináns szöveti transzglutamináz antigén szilárd fázisként = egyéb sejtkomponensek 6. ábra: Vázlatos tesztbeállítás 4/10 25
Pipettázás anti-humán peroxidáz konjugátumban = anti-humán peroxidáz konjugátum = szöveti transzglutamináz antitest = emberi, rekombináns szöveti transzglutamináz antigén szilárd fázisban szilárd fázisként 2. reakció: A konjugátum az antigén-antitest komplexszel kombinálódik. Inkubáljuk 30 percig 8. ábra: Vázlatos tesztbeállítás 6/10
3x mosás az üregből mosópufferrel = konjugált anti-humán peroxidáz = szöveti transzglutamináz antitest = emberi, rekombináns szöveti transzglutamináz antigén szilárd fázisként 9. ábra: 10 TMB pipettázás sematikus kísérleti beállítása 7 enzim szubsztrátban tetrametilbenzidin = konjugált anti-humán transzglutamináz = emberi peroxidáz = szövet, rekombináns szöveti transzglutamináz antigén szilárd fázisként = tetrametilbenzidin 10. ábra: Vázlatos kísérleti beállítás 8/10, TMB = tetrametilbenzidin 27
= Konjugált anti-humán peroxidáz = szöveti transzglutamináz antitest = emberi, rekombináns szöveti transzglutamináz antigén szilárd fázisban = tetrametilbenzidin inkubálva 10 percig sötétben 11. ábra: A 9. kísérlet vázlata: 10 = konjugált anti-humán transz-peroxidáz = szöveti transzglutamináz antitest = emberi szövet antigén, rekombináns Szilárd fázis = tetrametilbenzidin H 2 SO 4 = tetrametilbenzidin színváltozás után 3. reakció: -Az enzimjelölt konjugátum-antitest-antigén komplexek beállítják a szubsztrátumot a szubsztrátum színének vörösről sárgára változtatására - a reakciót kénsavval állítják le -30 perc múlva a leállítás után fotometrikus az optikai sűrűségeket 450 nm-en határozzuk meg 12. ábra: Vázlatos tesztelrendezés 10/10-ből, H 2 SO 4 = kénsav 28
2. táblázat: Normál eloszlás Kolmogorov-Smirnov-teszt szignifikancia-korrekcióval Lilliefors szerint ttg (iga) és ln [ttg (iga)], ttg (iga) = A típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen, ln = logaritmus az e bázishoz, n = szám Kolmogorov-Smirnov n Jelentőség ttg (iga) 73 000 ln [ttg (iga)] 73.032 13. ábra: A ttg (iga) abszolút titerértékeinek hisztogramja normál eloszlási görbével, ttg (iga) = A típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen 14. ábra: A logaritmikus hisztogramja A ttg (iga) e bázisának titerértékei normál eloszlási görbével, ln = e bázis logaritmusa, ttg (iga) = A típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen 31
15. ábra: A ttg (igg) abszolút titerértékeinek hisztogramja normál eloszlási görbével, ttg (igg) = G típusú antitestek a szöveti transzglutamináz ellen, ttg (igg) = szöveti transzglutamináz 33 elleni G típusú antitest
3.3 A ttg-igg és a ttg-iga titerek közvetlen összehasonlítása A ttg-iga és a ttg-igg titer meghatározásának eredményeinek és a tesztalanyok titereinek összehasonlító grafikus ábrázolásának közvetlen összehasonlításakor a következő nyilvánvalóvá válik: a minták 93% -ában (73/69-ből) Az IgA-titer meghaladja az IgG-t; 7% -ukban (69-ből 5-ben) az érték szignifikánsan magasabb, mint az IgG értéke (lásd 17-24. ábra). A minták 7% -ában (73-ból 5 esetben) az IgG-titer magasabb, mint az IgA-titer (lásd 17-24. Ábra). Ha összehasonlítjuk az IgA és az IgG oszlopdiagramjait, a következők láthatók: Az IgA és az IgG értékei nem korrelálnak egymással, azaz. H. a magas ttg-iga titer nem eredményez magas ttg-igg titeret. - Hasonlóképpen, az alacsony IgA-titer nem társul alacsony IgG-titerrel és fordítva. - Másrészt, ha az IgG-titer magas, az IgA-titer is magas. ttg IgA-IgG titer összehasonlításban 900 800 700 600 500 titer 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 minta száma ttg (IgA) ttg (IgG) 17. ábra: ttg IgA-IgG titer összehasonlításban, 1. minta száma -10, ttg (IgA) = szöveti transzglutamináz elleni A típusú antitestek, ttg (IgG) = szöveti transzglutamináz 34 elleni G típusú antitestek
ttg IgA-IgG titer összehasonlításban 400 350 300 250 titer 200 150 100 50 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Mintaszám ttg (IgA) ttg (IgG) 18. ábra: ttg IgA-IgG titer összehasonlításban, 11. minta száma 20, ttg (IgA) = szöveti transzglutamináz elleni A típusú antitestek, ttg (IgG) = szöveti transzglutamináz elleni G típusú antitestek ttg IgA-IgG titer összehasonlítva 500 450 400 350 300 titer 250 200 150 100 50 0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 minta száma ttg (IgA) ttg (IgG) 19. ábra: ttg IgA-IgG titer összehasonlításban, 21-30 mintaszám, ttg (IgA) = A típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen, ttg (IgG) = G típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen ttg IgA-IgG titer összehasonlításban 1000 900 800 700 600 titer 500 400 300 200 100 0 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 minta száma ttg (IgA) ttg (IgG) 20. ábra: ttg IgA-IgG titer összehasonlításban, 31-40. Minta száma, ttg (IgA) = A típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen, ttg (IgG) = G típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen 35
ttg IgA-IgG titer összehasonlításban 300 250 200 titer 150 100 ttg (IgA) ttg (IgG) 50 0 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 minta száma 21. ábra: ttg IgA-IgG titer összehasonlításban, minta 41-50, ttg (IgA) = szöveti transzglutamináz elleni A típusú antitestek, ttg (IgG) = szöveti transzglutamináz elleni G típusú antitestek ttg IgA-IgG titer összehasonlítva 1400 1200 1000 titer 800 600 400 200 0 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 minta száma ttg (IgA) ttg (IgG) 22. ábra: ttg IgA-IgG titer összehasonlításban, mintaszám 51-60, ttg (IgA) = A típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen, ttg (IgG) = G típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen ttg IgA- IgG-titer összehasonlításban 400 350 300 250 titer 200 150 100 50 0 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 mintaszám ttg (IgA) ttg (IgG) 23. ábra: ttg IgA-IgG titer összehasonlításban, 61-70. Minta, ttg (IgA) = A típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen, ttg (IgG) = G típusú antitestek szöveti transzglutamináz ellen 36