In vitro fluoreszcencia rezonancia energiaátadás felhasználásával tanulmányozzuk a fehérjekomplexek dinamikáját a

Összegzés

A fehérje-fehérje kölcsönhatások kritikusak a biológiai rendszerek szempontjából, és a kötési kinetika vizsgálata betekintést nyújt a fehérjekomplexek dinamikájába és működésébe. Leírunk egy módszert, amely mennyiségileg meghatározza egy fehérjekomplex kinetikai paramétereit fluoreszcencia-rezonancia-energiaátadás és a leállított áramlás technikája segítségével.

Absztrakt

Bevezetés

A biológiai aktivitást végül a fehérjék végzik, amelyek többsége kölcsönhatásba lép másokkal a megfelelő biológiai funkciók érdekében. Számítási megközelítést alkalmazva az emberben a fehérje-fehérje kölcsönhatások összmennyisége 650 000 lesz

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Töltse le a Cul1 • Cand1 komplex struktúrájú fájlját a Protein Data Bankról (1U6G fájl).
2. Mutassa meg a PyMOL Cul1 • Cand1 komplex szerkezetét.
3. A mérési funkció a menü alatt Asszisztensek "a PyMOL-tól megbecsülni a Cand1 első aminosavának és a Cul1 utolsó aminosavának távolságát (1. ábra).
4. Töltse le az online spektrumnézőt (lásd Anyagtáblázat), és egyszerre jelenítik meg a 7-amino-4-metil-kumarin (AMC) gerjesztési és emissziós spektrumait és villognak (2. ábra). Ne feledje, hogy az AMC a nyugtalan donor, a Blitz pedig a nyugtalanító.

1. ábra: A Cul1 • Cand1 kristályszerkezete és a potenciális jelölési helyek közötti távolság mérése. A kristályszerkezeti fájlt letöltöttük a Protein Data Bankról (1U6G fájl), és a PyMOL-ban néztük meg. A kiválasztott atomok közötti méréseket a PyMOL végezte. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

2. ábra: a fluoreszcens festékek gerjesztési és emissziós spektrumai Bund esetében. AMC (7-amino-4-metil-kumarin) és FlAsH spektrumok jelennek meg. A szaggatott vonalak gerjesztési, a folytonos vonalak pedig emissziós spektrumokat mutatnak. A képet eredetileg a fluoreszcencia SpectraViewer generálta, és a jobb érthetőség érdekében módosították. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

2. A Cul1 AMC • Rbx1, FRET donor fehérje elkészítése

1. Építsen plazmidokat az emberi Cul1 Sortase • Rbx1 expressziójához E. Coli sejtekben. Megjegyezzük, hogy az emberi Cul1 • Rbx1-t E. coli sejtekben Co expresszáló két plazmidot részletesen leírják egy korábbi jelentés 20.
   1. Adjunk hozzá egy "LPETGGHHHHHH" -ot (szortáz, szajna, 6 nap) kódoló DNS-szekvenciát a Cul1 kódoló szekvencia 3'-végéhez standard PCR-rel és 21., 22. klónozási módszerrel. .
   2. Az új plazmid szekvenciája a génbetét pontosságának megerősítésére.
2. Co Express Cul1 Sortase • Rbx1 E. Coli sejtekben. A módszer egy korábbi jelentésből származik 20.
   1. Keverjünk össze 100 ng két plazmidot BL21 (DE3) kémiailag kompetens sejtekkel együtttranszformációhoz a 23. hősokk módszer alkalmazásával. Növelje a sejteket LB agarlemezen 100 µg/ml ampicillinnel és 34 µg/ml kloramfenikollal 37 ° C-on egy éjszakán át.
   2. Inokuláljunk 50 ml LB-tenyésztést frissen transzformált telepekkel, és egy éjszakán át 37 ° C-on, 250 fordulat/perc sebességgel rázva növesztjük. Ez kezdő kultúrát ad.
   3. Inokuláljon 6 palackot, mindegyik 1 L LB táptalajjal, 5 ml kezdő tenyészettel, és 37 ° C-on, 250 fordulat/perc rázással növekszik az OD600-ig.

      3. Készítse elő a Flash-Cand1-et, a Bund akceptor fehérje

      Megjegyzés: Az ebben a részben szereplő lépések többsége megegyezik a 2. lépéssel. Az eltérő körülményeket az alábbiakban részletesen ismertetjük.

      40 µM-t a puffer membrán ultraszűrésen (30 kDa cut-off) átvitelével. Becsülje meg a fehérje koncentrációját a 280 nm-en mért abszorbancia segítségével. A fehérjét mentse 50 µL-es alikvotként -80 ° C-on.
      Megjegyzés: A protokoll itt szüneteltethető.

3. Flash Cand1 létrehozása.
   1. 1 µL gyorsoldatot adunk hozzá (lásd Anyagtáblázat) 50 µl TetraCys Cand1 oldathoz.
   2. Jól keverjük össze, és inkubáljuk a keveréket szobahőmérsékleten, sötétben 1-2 órán át FlAsH Cand1-re.
      Megjegyzés: A protokoll itt szüneteltethető.

4. Készítse elő a Cand1-et, a Bund üldözőfehérjét

MEGJEGYZÉS: A fehérje előállítási protokoll hasonló a 3. lépéshez, a következő változtatásokkal.

1. Helyezze be az esti hosszúságú Cand1 kódoló szekvenciáját a pGEX-4 t-2 vektorba.
2. Cserélje ki a 3.3.5. Lépésben használt puffert 30 mM Tris-HCl-t, 100 mM NaCl-t, 1 mM DVB-t, 10% glicerint tartalmazó pufferre.
3. Szüntesse meg a 3.3.7 és a 3.3.8 lépéseket.

5. Tesztelje és erősítse meg a Bund-vizsgálatot

6. Mérje meg a Cul1 • Cand1 sebességállandójának (vételének) összefüggését

MEGJEGYZÉS: A leállított áramlású fluoriméter működésének részleteit egy korábbi jelentés 26 írta le.

7. Mérjük meg a Cul1 • Cand1 disszociációs sebességi állandóját (koff) Skp1 • F-box fehérje jelenlétében.

Megjegyzés: Ez a lépés hasonló a 6. lépéshez a következő változtatásokkal.

1. Az A fecskendőben, a helyzet alatt kitölteni, Töltsön 100 nM Cul1 AMC • Rbx1 és 100 nM FlAsH Cand1 oldatot a pufferkötegbe. Forgassa el a "DRIVE" helyzet példáját.
2. Töltse be a B fecskendőbe a pozíció alatt kitölteni, az Skp1 • Skp2 megoldása (egy korábbi jelentés 20 szerint készült). Forgassa el a "DRIVE" helyzet példáját.
3. Nyisd meg Vezérlőpult alatt szerez Programozza az AMC-t 30 másodpercre a szoftverbe és a Cul1-kibocsátás rögzítésére. Ezután készítsen egyetlen felvételt. A fluoreszcens jelek az A fecskendő és a B fecskendő összekeverése után az idő múlásával növekednek (5. ábra).

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

3. ábra: Reprezentatív Bund teszt a Cul1 • Cand1 komplex képződéséhez. A csomó pufferben lévő minták (30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,5 mM DVB-t, 1 mg/ml ovalbumin, pH 7,6) 350 nm-en lelkesek voltak, és az emissziókat 400 nm-től 650 nm-ig pásztázták. (A) 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 (teljes) és mindkettő keverékének (FRET) kibocsátási spektruma. A Cand1 (teljes) a Cand1 teljes hosszúságát jelenti. (B) 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 és mindkettő keverékének (FRET) kibocsátási spektruma. A Cand1-et, amelynek első spirálját törölték, használtuk ebben a kísérletben, és utána is. (C) Chase emissziós spektrumok 70 nM Cul1 AMC-től, 70 nM FlAsH Cand1-től, mindkettő keverékétől (FRET) és a Bund-kontrolltól (Chase). A Chase minta 70 nM Cul1 AMC-t, 700 nM Cand1 és 70 nM FlAsH Cand1-t tartalmazott. (D) 70 nM Cul1 AMC, 70 nM Cul1 AMC és 70 nM FlAsH Cand1 (Bund) és 700 nM Skp1 • Skp1 • Skp2 keverékének emissziós spektruma hozzáadva a 70 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1 komplexhez. Az egyes ábrákon az emissziós jeleket 70 nm-es Cul1 AMC emisszióra normalizáltuk 450 nm-en. Az ábra nagyobb változatához kattintson ide.

A Cul1 • Cand1 vásárlásának mérésére a bevett FRET teszt alkalmazásával, a kódoló jelének időbeli csökkentésével a leállított áramlású fluoriméter monitoron először teszteltük és meghatároztuk a felhasználandó fehérje koncentrációját. 5 nM Cul1 AMC és FlAsH Cand1 alkalmazásakor nagyon kevés jelváltozást figyeltünk meg (4A. Ábra)) Míg amikor az egyes fehérjék koncentrációját 50 nM-re növelték, a jel időbeli csökkenését figyelték meg (4b. ábra)) és ezt a változást eltörölték, amikor a FlAsH Cand1 nélküli pufferek voltak (4. ábra)) hozzá lett adva. Ezért 50 nM Cul1 AMC-t alkalmaztunk a további elemzéshez, és számos megfigyelt asszociációs sebességi állandót (kObs) mértünk 50 nM Cul1 AMC és növekvő koncentrációjú FlAsH Cand1 keverésével. Az egyes kísérletek KOb-értékét úgy számítottuk ki, hogy beépítettük az exponenciális görbe referenciáit, és az azonos FlAsH Cand1 koncentrációból kapott kOb-értékeket átlagoltuk. Ábrázoljuk az átlagos kOb-értékeket a Cand1 koncentrációval és lineáris regresszióval (4. ábra)) végre, a vétel meghatározása 7.27 .

4. ábra: A klub sebességállandójának reprezentatív mérése. (A) az 5 nM Cul1 AMC fluoreszcenciáját leállított áramlású fluoriméterrel figyeltük az idő múlásával 5 nM FlAsH Cand1 hozzáadása után. (B) az 50 nM Cul1 AMC fluoreszcenciáját leállított áramlású fluoriméterrel figyeltük az idő múlásával 50 nM FlAsH Cand1 hozzáadása után. (C) az 50 nM Cul1 AMC fluoreszcenciáját leállított áramlású fluoriméterrel figyeltük idővel a Bund puffer hozzáadása után. (D) vásároljon a C1-hez kötődő Cand1 kötvényért. k-Obs of Cul1 • A Cand1 a Cand1 különböző koncentrációiban jelenik meg. A lineáris meredekség 1,8 x 10 7 M -1 s -1 értéket ad. A hibasávok megjelenítése ± SEM; n = 4. Az összes mintát csomópufferben készítettük és 350 nm-en gerjesztettük. Az AMC-ből származó jelek összegyűjtésére és a villámjelek kizárására sávszűrőt használtunk. Nem normalizáltak adatokat. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

A vásárlás méréséhez hasonlóan mi is mértük a Cul1 • Cand1 megfigyelt disszociációjának állandó állandóját azáltal, hogy figyeltük a donorjel időbeli növekedését (visszanyerését) a leállított áramlású fluoriméteren. Először a Cul1 AMC-t és a FlAsH Cand1-t kevertük össze, majd Skp1 • Skp2-t adtunk az előre összeállított Cul1 AMC • FlAsH Cand1-hez a leállított áramlású fluoriméteren. A kódolójel gyorsan növekszik, és 0,4 s -1 kObs-t mutat (5. ábra)). Ezzel szemben, amikor puffert adtunk az előre összeállított Cul1 AMC • FlAsH Cand1-hez, a jel növekedése nem volt megfigyelhető, ami arra utal, hogy a Cul1 • Cand1 gyors disszociációját Skp1 • Skp2 váltotta ki.

5. ábra: A disszociációs sebességi állandó reprezentatív mérése. A donor fluoreszcenciájának az időhöz viszonyított változását 150 nM Skp1 • Skp2 vagy Bund puffer hozzáadásával 50 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1 komplexhez adtuk. A jelváltozásokat egy exponenciális görbéhez illesztettük, és megfigyelt disszociációs sebességi állandó állandó 0,4 s -1. A kísérleti körülmények hasonlóak voltak, mint a 4. ábránleírták. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Mivel a fret érzékeny és mennyiségi, fontos eszközzé vált a makromolekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozásában. Ez a protokoll példát mutat a fret használatára az oldatban lévő fehérjekomplexek dinamikájának tanulmányozásához. A Bundot az élő sejtek képalkotásával együtt az élő sejtek molekuláris kölcsönhatásainak tanulmányozásához is használták 36, amely nagyban feltárja a fehérjekomplexek dinamikáját fiziológiai körülmények között. Ezenkívül a fret egyetlen molekula szinten is használható, a 37, 38 makromolekuláris komplexek valós idejű dinamikájának tanulmányozása, a komplex konformációs változásának betekintése. A fret hatékonyságának és detektálásának javítása érdekében a fluorofórok és a fényerővel és fotostabilitással rendelkező bioszenzorok nagy érdeklődésre tartanak számot, amelyeket aktívan fejlesztenek és tanulmányoznak 28, 39 .

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

---